Лечение медом дисбактериоза кишечника: Дисбактериоз боится меда

Содержание

Дисбактериоз боится меда

Продукты пчеловодства применяют врачи самых разных специальностей, в том числе иммунологи, косметологи и педиатры. В чем заключена биологическая ценность народной сладости, выяснял корреспондент Infox.ru.

У каждого сорта меда — свои лечебные свойства. Гречишный полезен при гипертонии, анемиях, малокровии. Пустырниковый снимает нервное напряжение. Кориандровый повышает потенцию. Акациевый улучшает кровообращение, регулирует функции желудка и кишечника, снимает изжогу. Мед из боярышника применяют при сердечно-сосудистых заболеваниях. Мед любого сорта в объеме двух-трех чайных ложек в день нормализует обмен веществ и повышает иммунитет.

Мед за иммунитет

Комментирует врач восстановительной медицины, апигирудотерапевт Ольга Шишова: «Пчелиный мед имеет состав, практически соответствующий составу нашей крови. За счет того, что в меде содержатся все те же микроэлементы, что и в крови, мы называем его «вторая кровь» для нашего организма. Особенно полезна «медовая водичка» (чайная ложка меда на стакан воды. —

Infox.ru), все элементы с чайной ложки меда войдут в организм. Восстановятся и эритроциты, их состав, и они станут лучше переносить кислород. Медовая вода также способствует улучшению деятельности лейкоцитов, иммунных клеток. Все продукты пчеловодства обладают иммуностимулирующими свойствами — улучшается состав плазмы, лейкоциты начинают двигаться более активно и выполнять свою функцию по уничтожению той паразитарной микрофлоры, которую мы имеем».

И не только мед

Мед в сотах еще полезнее, поскольку в нем еще не произошло никаких окислительных процессов. К тому же пчелиный воск выводит токсины из организма. Перга — продукт пчеловодства — сохраняет все свойства меда, а маточное молочко омолаживает организм на клеточном уровне. «Для того чтобы бороться с паразитарной микрофлорой в организме, необходимо задействовать прополис, — поясняет Ольга Шишова. — Прополис так и называют — природный антибиотик. Я использую прополис натуральный для применения внутрь, прополисные свечи для местного воздействия. Для того чтобы отработать весь антибактериальный аспект, на помощь продуктам пчеловодства призываем и травы. Сейчас это большая проблема, потому что после применения антибиотиков нам необходимо восстановить состояние слизистых оболочек».

Аллергия на мед

Существует мнение, что если у человека аллергия на мед, то его нельзя употреблять ни в каком виде. Это не так. Аллергия бывает не на мед, а на те растения, из которых он собран. «При аллергии на мед, если мы посмотрим на анализы крови, всегда имеется и патология пищеварительной системы, — говорит Ольга Шишова. — То есть организм не переносит не отдельные белковые вещества, а сразу множество. Никогда не бывает моноаллергии, то есть непереносимости какого-либо одного вещества».

Например, при аллергических высыпаниях на мед из липы или каштана человеку вполне могут подойти такие сорта, как мятный, мелиссовый, луковый или лопуховый.

Карта сайта

Адреса клиник г. Казань

Адрес: ул. Гаврилова, 1, ост. «Гаврилова» (пр. Ямашева)

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00

Автобус: 10, 10а, 18, 33, 35, 35а, 36, 44, 45, 46, 49, 55, 60, 62, 76

Троллейбус: 2, 13

Трамвай: 5, 6

Адрес: ул. Т.Миннуллина, 8а, (Луковского) ост. «Театр кукол»

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00

Автобус: 1, 2, 31, 37, 47, 74

Троллейбус: 6, 8, 12

Метро: Суконная слобода

 

 

Адрес: ул. Сыртлановой, 16, ст. метро Проспект Победы, ост. ул. Сыртлановой (проспект Победы)

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00 

Автобус: 5, 34, 37, 62 77

Трамвай: 5

Метро: Проспект Победы

Адрес: ул. Назарбаева, 10, ст. метро «Суконная Слобода», ост. «Метро Суконная Слобода»

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: выходной

Автобус: 1, 4, 25, 43, 71

Метро: Суконная слобода

 

 

Адрес: ул. Декабристов, 180, ст. метро «Северный вокзал», ост. «Гагарина»

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: выходной

Автобус: 6, 18, 29, 33, 37, 40, 43, 53, 62, 76, 78, 89

Троллейбус: 13

Трамвай: 1, 6

Метро: Северный вокзал

Адрес: пр. А.Камалеева, 28/9, (жилой комплекс «XXI век»), ост. «Новый ипподром»

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00 

Троллейбус: 3

 

 

Адрес: Дербышки, ул. Мира, 20, ост. «Магазин Комсомольский», «Гвоздика»

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00 

Автобус: 1, 19, 25, 34, 44, 60, 84

Адрес: ул. Серова, 22/24, ост. «ул. Серова»

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00 

Автобус: 10, 10а

 

 

Адрес: ул. Беломорская, 6, ст. метро «Авиастроительная», ост. «ул. Ленинградская»

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00 

Автобус: 6, 18, 33, 37, 40, 42, 43, 53, 60, 78, 89, 93

Троллейбус: 13

Трамвай: 1

Метро: Авиастроительная

Адрес: ул. Закиева, 41а, ост. «Кабельное телевидение»

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00 

Автобус: 5, 18, 30, 31, 34, 45, 46, 62, 63, 77, 89

Троллейбус: 3, 5, 9, 12

 

 

Адрес: ул. Кул Гали, 27, ост. «ул. Кул Гали» (ул. Габишева)

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: выходной

Автобус: 46, 90

Адрес: ул. Рихарда Зорге, 95, м. «Дубравная», ост. «ул. Юлиуса Фучика»

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00

Автобусы: 5, 18, 30, 31, 33, 34, 45, 68, 74, 77

Троллейбусы: 5, 9, 12

Трамвай: 4

Метро: Дубравная

Адрес: ул. Фрунзе, 3а, ост. «Идель»

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: выходной 

Автобусы: 10а, 36, 49, 53, 63, 72, 106

Троллейбус:1

 

Дисбактериоз кишечника: симптомы, коррекция и лечение дисбиоза у взрослых и детей, степени, анализы и профилактика

Дисбактериозом (дисбиоз) называют симптоматическое состояние, характеризующееся нарушением микрофлоры кишечника. В кишечнике в этот момент размножаются патологические бактерии, и нарушается естественный микробный баланс.

Причины дисбактериоза

Существуют различные предпосылки и состояния, которые способны привести к развитию дисбактериоза:

  • заболевания органов ЖКТ,
  • прием лекарственных препаратов, нарушающих микрофлору кишечника (антибиотики),
  • неправильное питание,
  • физиологические возрастные изменения,
  • прием гормональных препаратов,
  • курсы лучевой и химиотерапии,
  • стрессы и неправильный режим дня,
  • пищевые отравления,
  • инфекционные процессы в организме.

Банальные респираторные инфекции или аллергические заболевания могут стать причиной нарушения микрофлоры кишечника, так как в этот период пациенту могут назначаться различные лекарственные препараты, негативно влияющие на микробный баланс.

Как понять, что у вас дисбиоз?

На разных стадиях заболевания симптоматика дисбактериоза различна. Специалисты рекомендуют обращать внимание на следующие проявления:

  • отрыжка,
  • тошнота,
  • урчащие звуки в животе,
  • вздутие и метеоризм,
  • ноющие или режущие боли в области живота,
  • запоры либо диарея и жидкий стул,
  • сухость кожных покровов,
  • неприятный привкус и запах изо рта,
  • утомляемость и нарушение сна.

Наличие одного или нескольких перечисленных симптомов – повод обратиться к врачу.

Диагностика дисбактериоза

Самостоятельно диагностировать состояние дисбактериоза невозможно. Поставить точный диагноз способен только опытный специалист, который обследует пациента при помощи лабораторных методов и специальной аппаратуры. Обратившись за медицинской помощью, пациент проходит обследование, которое включает:

  • исследования мочи и кала,
  • ПЦР-диагностику микрофлоры,
  • визуальный осмотр кожных покровов.

Профилактика дисбактериоза

Развитие заболевания можно предотвратить, если внимательно следить за питанием, избегать стрессовых состояний, соблюдать режим сна и отдыха, не употреблять необоснованных лекарственных препаратов, занимаясь самолечением, контролировать состояние органов желудочно-кишечного тракта.

Что будет, если не лечить дисбактериоз?

Если не лечить дисбиоз, заболевание может перейти в более тяжелую форму, и не исключено появление осложнений. В результате этих процессов в кишечнике будут образовываться токсические вещества, которые с кровотоком будут разнесены по всем органам и тканям. Всасывание и усвоение минералов и витаминов будет нарушено, иммунитет организма ослабнет, и защитные свойства значительно снизятся. Пациент будет легко подвержен различным инфекциям, банальное расстройство кишечника может привести к серьезным заболеваниям, лечение которых нередко требует оперативного вмешательства.

Как вылечить дисбактериоз?

При лечении дисбактериоза важнейшим шагом становится лечение основного заболевания, которое вызвало патологию в кишечнике пациента. Затем проводится терапия по восстановлению микрофлоры кишечника, наиболее правильно подбирать препараты на основе лабораторных исследований посева.

Диета при дисбактериозе

В период лечения и для предупреждения рецидивов необходимо исключить употребление жирного, острого, соленого, жареного, не пить алкоголь. Питание должно быть сбалансированным и щадящим, в рационе должны присутствовать кисломолочные продукты.

Проконсультироваться о диагностике и лечении дисбактериоза и записаться к специалисту вы можете, позвонив в нашу клинику или записавшись через форму на сайте.

УЗНАТЬ ЦЕНЫ

Дисбактериоз кишечника / Статьи

Под дисбактериозом кишечника зачастую подразумевают заболевание, но по словам работников медицинской сферы, точнее вести речь о синдроме, когда нарушается количественный и качественный состава микрофлоры. В здоровом кишечнике превалирую полезные бактерии – в случае дисбактериоза они гибнут, и на их место приходят микроорганизмы патогенного характера.

В чем здесь заключается опасность?  

  • Нарушается обмен веществ.
  • Ухудшается синтез витаминов
  • Ухудшается выработка микро – и макроэлементов.

Этот синдром ведет к появлению авитаминоза хронического характера, к развитию неспособности организма противостоять заболеваниям. Из-за недостатка витамина B «падает» зрение, образуется конъюнктивит и прочие глазные заболевания. Дефицит витамина A провоцирует дерматит и сухость кожи. Проблемы с витамином D – хрупкие кости и даже остеопороз. Вообще проблем со здоровьем из-за дисбактериоза существует масса.

Причины возникновения и способы борьбы с недугом

Стрессы – пусковые факторы для развития дисбактериоза, а также прием пищи и воды, несвойственных человеку (например, в заграничных поездках), а также инфекции, прием антибиотиков.

Кроме того, важно смотреть и на повседневную деятельность человека – дисбактериоз могут «заработать» лица, которые злоупотребляют чипсами, газировкой, шоколадом, консервированными продуктами.

По этой причине в период лечения сильнодействующими лекарствами или в отпуске нужно сберечь микрофлору и пить препараты натурального происхождения, в которых есть полезные бактерии для всего кишечника. «Линекс», например, способствует восстановлению бактериального баланса в организме. В качестве профилактики и дополнительных мер нужна организация правильного питания- есть больше кисломолочных продуктов, фрукты, овощи, каши. Топинамбур богат олигосахаридами, что стимулирует рост полезных кишечных бактерий.

Расстройство пищеварения – это первый тревожный маячок, показывающий на дисбактериоз. Вздутие живота, диарея, кишечный дискомфорт должны насторожить! Здесь настоятельно применять средства для снятия симптомов «Имодиум», «Лопедиум» и «Смекта», но лишь для облегчения на время. Симптомы довольно быстро возвращаются.

Изменения веса в обе стороны  — резкий набор или похудение – тоже говорят о проблеме. Также должны вызвать закономерное беспокойство высыпания на коже.

Все причисленное в сочетании с ослабленным иммунитетом – просто-таки призыв обратиться к специалисту и сдать анализы на возможный дисбактериоз кишечника.

Если диагноз подтвердится, терапевт или гастроэнтеролог назначает курс лечения, т.е. ряд процедур, в ходе которых восстанавливается состав микрофлоры кишечника.

Гастроэнтерология » МедАрт, г.Томск

Что такое дисбактериоз?

Дисбактериоз – состояние, при котором происходит нарушение количественного состава или нормального микробного состава кишечника. 
       У каждого здорового человека в кишечнике находятся бактерии, способствующие перевариванию пищи и выполняющие ряд других полезных функций. В случае ослабления иммунной системы происходят нарушения и в микрофлоре кишечника. Представители нормальной микрофлоры (молочнокислые и кишечные палочки, бифидобактерии и др.) сокращаются в количестве, а количество микроорганизмов (стафилококк, синегнойная палочка, кандида и т.д.) увеличивается. 

Чем опасен Дисбактериоз?

При дисбактериозе страдает не только полостное (в просвете кишки), но и пристеночное (на стенках кишечника) пищеварение. При воспалении слизистой оболочки ухудшается восстановление ее клеток, что ведет к прогрессирующей атрофии слизистой, снижению адсорбционной способности клеток и нарушению пристеночного пищеварения. Это приводит к накоплению в просвете кишки не до конца расщепленных продуктов, что проявляется поносом, урчанием в кишечнике, вздутием живота. Параллельно с этим развивается дисфункция толстой кишки. Помимо местного и общего воздействия продуктов бактериального обмена и вредных веществ (токсинов), утрачивается способность микробов переводить пищеварительные ферменты, поступающие из верхних отделов кишечника, в неактивную форму, и они в больших количествах выделяются вместе с фекалиями. Из-за дисбактериоза ухудшается синтез основных бактериальных витаминов и их усвоение в кишечнике, нарушается обмен веществ. Дисбактериоз приводит к появлению аллергенных факторов, которые способны затянуть течение воспалительных заболеваний пищеварительного тракта.

      Дисбактериоз служит фоном для развития многих заболеваний. А сочетанный дисбактериоз не только способствует многим патологическим процессам, но может иметь и собственные клинические проявления.

В итоге резко ослабевают физиологические, в частности защитные, функции кишечника. Частые простуды, аллергии, гинекологические расстройства, кожные высыпания и, разумеется, желудочно-кишечные расстройства — вот перспективы запущенного дисбактериоза. Дисбактериоз кишечника может приводить к дисбактериозу мочеполового тракта, зева. Нарушение баланса кишечной микрофлоры служит толчком к развитию острых и обострению хронических заболеваний.

Причины дисбактериоза:

-длительный прием антибиотиков;

-наличие различных хронических и функциональных заболеваний органов и систем. Особенно это касается органов ЖКТ;

-злоупотребление алкоголем;

-нерациональное питание;

-состояние серьезного иммунодефицита. Они возникают при СПИДе, некоторых видах рака, химиотерапии;

-наличие в кишечнике паразитов или болезнетворных микробов (дизентерия, сальмонеллез, вирусные заболевания). Они выделяют вещества, которые также убивают полезных микробов;

-постоянное пребывание в состоянии стресса и неблагоприятная экология.

Основные симптомы дисбактериоза.

     Симптомы дисбактериоза являются неспецифичными. Это могут быть: отрыжка, тошнота, изжога. Иногда при этом появляются неприятный запах изо рта, неприятный привкус во рту, может даже держаться субфебрильная температура. У некоторых людей возникают аллергические реакции на безобидные продукты.

Обычно пациенты при дисбактериозе кишечника также жалуются на чувство дискомфорта в животе и повышенное газообразование. Их начинают беспокоить различные нарушения стула: поносы, запоры или неустойчивый стул. Некоторые люди отмечают боли в животе.

Нужно знать, что дисбактериоз всегда приводит к усугублению течения различных хронических заболеваний пищеварительного тракта. По этой причине крайне важно вовремя диагностировать и начать лечить дисбактериоз.

При появлении этих симптомов необходимо обратиться к ГАСТРОЭНТЕРОЛОГУ. Для диагностики данного состояния применяют:

-эндоскопическое исследование;

-посев кала на флору (анализ кала на дисбактериоз).

Лечение дисбактериоза заключается в:

-соблюдение диеты;

-приеме бактериальных препаратов для восстановления кишечной флоры;

-применение спазмолитиков, препаратов осмотического действия и пробиотиков;

-нормализации моторики кишечника.

Профилактика дисбактериоза.

    Чтобы дисбактериоз не появился, необходимо проводить его профилактику. Первичная профилактика дисбактериоза является достаточно непростым делом. Ведь для этого нужно улучшить экологию, питание, избавиться от стрессов и негативного воздействия разнообразных факторов внешней и внутренней среды.

Вторичная профилактика подразумевает рациональное применение антибиотиков и других медикаментов, которые могут нарушить эубиоз. Необходимо вовремя и правильно лечить болезни органов пищеварения, которые могут нарушить микробиоценоз.

Большое внимание нужно уделять рациональному режиму питания. Пища должна иметь сбалансированный состав.

Если приходится принимать антибиотики, то одновременно следует использовать специальные препараты, которые способствуют поддержанию роста и развития нормальной микрофлоры кишечника.

 

Признаки и причины дисбактериоза — сеть клиник НИАРМЕДИК

Симптомы дисбактериоза кишечника

Симптомы дисбактериоза кишечника у взрослых и детей аналогичны признакам различных заболеваний желудочно-кишечного тракта, которые сопровождаются следующими проявлениями:

  • отрыжкой;
  • тошнотой;
  • изжогой;
  • вздутием живота;
  • поносами;
  • запорами;
  • неприятным привкусом во рту;
  • неприятным запахом изо рта;
  • болями в животе;
  • аллергическими реакциямидаже на безобидные продукты питания;
  • субфибрильной температурой.

При дисбактериозе в первую очередьпод удар попадаетпроцесс пищеварения. Пищу в кишечнике сначала расщепляют бактерии, а уже потом она всасывается в кровь. Без содействияполезных микробовчеловеческий организм не может полноценно усвоить необходимые питательные вещества. Поэтому и появляются такие признаки дисбактериоза кишечника как тошнота, рвота, жидкий стул и т.п.

Диагностика дисбактериоза

Для определения наличия и характера дисбактериоза кишечника необходимо сдать анализ, чтобы выяснить, какие именно микроорганизмы и в каком количестве населяют кишечник. Применяются следующие методы диагностики:

  • Бактериологическое исследование. Результат данного анализа готовится восемь дней – именно столько времени в среднем нужно для того, чтобы бактерии выросли в специальных питательных средах и стали доступны для выявления. Качество результатов зависит от соблюдения сроков доставки, от качества материала и особенностей и трудностей культивирования отдельных видов бактерий.
  • Метод обследования метаболитов микрофлоры, основанный на определении летучих жирных кислот, выделяемых микробами в процессе своего развития. Способ отличается высокой чувствительностью и очень прост в определении микробов, а также позволяет получить результат уже в течение нескольких часов.

Необходимо учитывать, что состав микрофлоры кишечника у каждого человека индивидуален. Это зависит от возраста, рациона питания, и даже от времени года. Потому одних лишь анализов для установления диагноза недостаточно. Обычно требуется дополнительное обследование для выявления причин дисбактериоза.

На сегодняшний день не существует ни одного способа диагностики, который позволил бы уверенно говорить о наличии кишечного дисбактериоза. Симптомы, приписываемые этому заболеванию, обычно являются проявлениями какого-либо основного заболевания. Малоинформативным является даже широко распространенный анализ на дисбактериоз у детей. Копроскопия не дает совсем никакой информации о микроорганизмах в кишечнике, только выявить наличие паразитов в некоторых случаях.

Лечение дисбактериоза

В сети клиник НИАРМЕДИК в большинстве случаев проводят комплексное лечение дисбактериоза кишечника у взрослых и детей, так как заболевание часто связано с нарушением моторики кишечника, синдромом раздраженного кишечника, а также психоэмоциональными нарушениями. Выбор методовлечения зависит от того, как протекает заболевание, на фоне которого проявляется кишечный дисбактериоз, а также от преобладающих симптомов.

Эффективные мероприятия по лечению дисбактериоза обычно направлены на то, чтобы:

  • изменить образ жизни,
  • соблюдать диету.

Огромное значение в терапии дисбактериоза имеет пересмотр образа жизни и правильное питание. Пациентам рекомендуется:

  • избегать работы, требующей большой физической нагрузки;
  • избегать психоэмоциональных потрясений и стрессовых ситуаций;
  • дозировать регулярную физическую нагрузку – это оказывает положительное влияние на нервную систему и позволяет избавиться от депрессии.

Основные принципы питания при дисбактериозе

  • кишечник должен быть максимально защищен от механического, химического и термического воздействия пищи;
  • еда должна быть полноценной и разнообразной;
  • пища должна содержать все необходимые витамины и микроэлементы;
  • питаться следует по определенному графику в строго определенные часы;
  • последний прием пищи должен быть не позднее, чем за три часа до сна;
  • кушать следует медленно, хорошо пережевывая пищу, не отвлекаясь на чтение, разговоры или просмотр телевизора;
  • соблюдать рекомендации врача по употреблению или же исключения из рациона тех или иных продуктов;
  • устранить избыточное размножение вредных микроорганизмов в кишечнике.

Лечение антибиотиками должно осуществляться исключительно по показаниям врача. Антибактериальные препараты применяются только при сильном дисбактериозе с угрозой попадания микробов из кишечника в кровь и развитии сепсиса.

В остальных случаях лечение начинают с кишечных антисептиков, которые назначаются на 10-14 дней. Данные препараты оказывают более мягкое воздействие, не нарушают нормальную микрофлору, и при этом значительно снижают количество болезнетворных бактерий. Если антисептики не дали эффекта, могут назначить антибиотики.

Имплантировать нормальную кишечную микрофлору

Для восстановления микрофлоры применяются пробиотики — препараты, которые содержат представителей нормальной флоры кишечника и пребиотики — лекарства, облегчающие их выживание и размножение в кишечнике.

Самые изученные и полезные бактерии для кишечника – это бифидо и лактобактерии. Пробиотики применяются регулярно, длительно (в течение 1-2-х месяцев) и дозировано.

Повысить иммунитет для создания естественной микрофлоры кишечника

Пациентам со сниженным иммунитетом могут назначить иммуностимуляторы и витамины в дополнение к диете.

Также могут применяться адсорбенты – препараты, которые обладают вяжущим и обволакивающим действием, а также впитывают растворы токсинов.

Профилактика дисбактериоза кишечника

Профилактика дисбактериоза состоит из лечения антибактериальными средствами, обязательного общеукрепляющего лечения и полноценного питания для ослабленных пациентов.

Питание (диета) при дисбактериозе кишечника

Дисбактериоз кишечника проявляется в тот или иной момент у большинства взрослых людей и практически у всех детей. Причин, вызывающих это состояние может быть множество и, конечно, уберечь себя от всех причин развития дисбактериоза просто невозможно. На состоянии кишечной микрофлоры может отразиться и экология, и хронический стресс, и различные заболевания и даже эмоциональное состояние. Однако здоровье человека, и особенно состояние пищеварительной системы, во многом зависит от того, что он ест. Лучшим способом профилактики дисбактериоза является полноценное, сбалансированное питание.

Но что делать, если дисбактериоз уже развился? Как восстановить баланс микрофлоры? Лечение дисбактериоза должно быть комплексным и рекомендованным гастроэнтерологом индивидуально в каждом случае. Однако можно и самостоятельно помочь своему организму, изменив стиль питания. Питание при дисбактериозе кишечника не должно содержать продуктов, раздражающих слизистую оболочку желудка и кишечника или способствующих процессам гниения и гиперсекреции желчи и желудочного сока. Другими словами, питание при дисбактериозе должно помочь восстановлению нормальной микрофлоры и облегчить работу желудочно-кишечного тракта.

Диета при дисбактериозе кишечника предполагает ограничение употребления острых и соленых блюд, специй и маринадов. Из рациона следует исключить кондитерские изделия, содержащие большое количество сахара, т.к. они усиливают нежелательные процессы брожения в кишечнике. Поэтому от конфет, шоколада, пирожных и тортов придется отказаться. Хлеб и сдобу лучше заменить сухариками. О любых консервированных продуктах, соленых и маринованных заготовках, тоже лучше забыть на время лечения от дисбактериоза. Также не стоит нагружать желудок и кишечник жирным мясом и рыбой, грибами, колбасами, копчениями и бобовыми. Оптимально диета при дисбактериозе кишечника должна состоять из нежирных продуктов, приготовленных на пару с ограниченным применением специй. Полезно готовить супы и каши (кроме перловой и пшеной).

Что касается напитков, то диета при дисбактериозе кишечника не должна включать кофе с молоком, и конечно, алкоголь. Особенно вредны при этом заболевании слабоалкогольные напитки, такие как пиво и вино, способные вызвать обострение. Лучше всего в период лечения пить несладкие компоты, воду и чай. Кроме того, стоит помнить, что напитки разжижают желудочный сок, что затрудняет процессы переваривания. Поэтому старайтесь пить как минимум за двадцать минут до еды и через час после, а не вовремя приема пищи.

Ещё статьи:

Влияние диетического меда на микрофлору кишечника и токсичность микотоксинов у мышей

BMC Complement Altern Med. 2006; 6: 6.

, 1 , 2 , 3 и 4

Али М Эзз Эль-Араб

1 Департамент пищевых наук и питания, Национальный исследовательский центр, 12644 — Докки, Гиза, Египет

Шенуда М. Гиргис

2 Департамент клеточной биологии, Национальный исследовательский центр, 12644 — Докки, Гиза, Египет

Эман М. Хегази

3 Департамент пищевой токсикологии, Национальный исследовательский центр, 12644 — Докки, Гиза, Египет

Аззат Б. Абд Эль-Халек

4 Департамент молочных продуктов, Национальный исследовательский центр, 12644 — Докки, Гиза, Египет

1 Департамент пищевых наук и питания Национального исследовательского центра, 12644 — Докки, Гиза, Египет

2 Департамент клеточной биологии, Национальный исследовательский центр, 12644 — Докки, Гиза, Египет

3 Департамент пищевой токсикологии, Национальный исследовательский центр, 12644 — Докки, Гиза, Египет

4 Департамент молочных продуктов, Национальный исследовательский центр, 12644 — Докки, Гиза, Египет

Автор, отвечающий за переписку.

Поступило 20 февраля 2005 г .; Принято 14 марта 2006 г.

Copyright © 2006 Ezz El-Arab et al; лицензиат BioMed Central Ltd.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе. при условии правильного цитирования оригинала.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Фон

Пчелиный мед — это функциональный корм, обладающий уникальным составом, антимикробными свойствами и бифидогенным действием.Настоящее исследование было предпринято для того, чтобы оценить, может ли мед подавлять токсическое действие микотоксинов.

Методы

Производство биомассы и токсинов с помощью Aspergillus parasiticus и Aspergillus ochraceus исследовали в средах без меда и с медом. Хотя афлатоксины и охратоксин А вводили самцам швейцарских мышей-альбиносов в дозах до 1 мкг и 10 нг / кг массы тела / день соответственно. Подопытных животных кормили диетами без нашего 10% меда в течение двух месяцев.Следили за изменениями в пробиотических бактериях толстой кишки, детерминантном ферменте толстой кишки глюкуронидазе и генотоксичности.

Результаты

Добавление 32% в среду увеличивало биомассу A parasiticus , в то время как биомасса A. ochraceus уменьшалась, и охратоксин A. не производился. Когда в среду добавляли мед в соотношении 32 и 48%. Связи между массой мицелия и продукцией микотоксинов не обнаружено. Пероральный прием афлатоксинов (смесь B 1 , B 2 , G 1 и G 2 ) и охратоксина А.вызывали структурные и численные хромосомные аберрации в костном мозге и половых клетках самцов мышей, тогда как лечение медом снижало генотоксичность микотоксинов. Также оба токсина вызывали гистопатологические изменения в печени и почках. Питание на диете с добавлением меда улучшило гистопатологические изменения в случае группы афлатоксинов, но не в случае группы охратоксина А. (за исключением почек в двух случаях). Не было обнаружено значительных различий в активности β-глюкуронидазы толстой кишки между группами, получавшими диету с медом или без него.С другой стороны, количество бифидобактерий толстой кишки и лактобацилл заметно увеличилось в группе, получавшей диету с добавлением меда.

Заключение

Замена сахара на мед в обработанных пищевых продуктах может подавлять вредные и генотоксические эффекты микотоксинов и улучшать микрофлору кишечника.

Общие сведения

Пищевые продукты больше не ценятся потребителями только с точки зрения их вкуса и непосредственных потребностей в питании, но также с точки зрения их способности обеспечивать определенную пользу для здоровья.Функциональные продукты питания стали важным сектором пищевых продуктов, обеспечивающим пользу для здоровья благодаря функциональным ингредиентам в этих продуктах. Функциональные продукты питания, направленные на улучшение баланса и активности кишечной среды, в настоящее время составляют самый большой сегмент рынка функциональных продуктов питания [1,2].

В течение долгого времени было замечено, что мед можно использовать для лечения заболеваний печени, сердечно-сосудистой системы и желудочно-кишечного тракта [3]. Мед — это натуральный продукт с очень сложным химическим составом. Он состоит в основном из фруктозы и глюкозы, но также содержит от 4 до 5% фруктоолигосахаридов, которые служат пребиотическими агентами [4].Он содержит более 180 веществ, в том числе аминокислоты, витамины, минералы и ферменты [5]. Антимикробные свойства перекиси водорода и неперекисных компонентов меда проверялись в нескольких исследованиях [6].

Распространенность заражения микотоксинами (афлатоксинами и охратоксинами) носит глобальный характер. По оценкам, четверть сельскохозяйственных культур в мире в той или иной степени загрязнены микотоксинами, особенно распространенными в развивающихся странах. Как правило, микотоксины обычно содержатся в пищевых продуктах [7,8].Микотоксины вызывают серьезную озабоченность из-за их пагубного воздействия на здоровье людей и животных. Aspergillus flavus и A. parasiticus продуцируют афлатоксины. Охратоксин А был открыт как метаболит Aspergillus ochraceus . Из токсинов Aspergillus только охратоксин (природный канцероген и нефротоксин) потенциально так же важен, как афлатоксины (природный канцероген). Оба они связаны как с токсичностью, так и с канцерогенностью для здоровья человека.Ведущий деятель в области оценки риска назвал микотоксины наиболее важным хроническим диетическим фактором риска, превосходящим синтетические контаминанты, токсины растений, пищевые добавки или остатки пестицидов [7,9].

Загрязняющие пищевые вещества, попадающие в организм оральным путем, напрямую подвергаются действию кишечной микрофлоры. Микрофлора желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) все чаще признается одним из факторов, влияющих на здоровье человека. Эта микрофлора представляет собой динамическое равновесие, которое может быть изменено диетой [10].Нормальная здоровая микрофлора кишечника содержит множество штаммов молочнокислых бактерий (LAB), некоторые из которых были выделены, приписаны несколько полезных эффектов и названы штаммами пробиотиков [11]. Несколько исследований показали, что пробиотические бактерии толстой кишки могут удалять микотоксины посредством физического связывания в качестве механизма удаления мутагена [12-14]. Кроме того, тяжесть отравления микотоксинами может быть усилена такими факторами, как дефицит витаминов, недостаток калорий, злоупотребление алкоголем и статус инфекционного заболевания [7].

Кроме того, есть доказательства того, что пробиотические бактерии толстой кишки могут положительно модулировать определенные микробные ферменты толстой кишки, которые могут играть роль в заболеваниях, связанных с диетой. Изменение этих параметров указывает на защитный эффект от канцерогенов. Пробиотические бактерии связывают мутагены in vitro , а также предотвращают выведение мутагенов из организма человека. Однако необходимы дополнительные исследования для определения физиологического значения эндогенных пробиотических бактерий толстой кишки [15].

Полное устранение любых естественных токсинов из продуктов питания — недостижимая цель. Наука о питании расширяет знания о том, как продукты питания влияют на потребителей в зависимости от конкретных параметров здоровья.

Следовательно, необходимо провести более глубокие исследования, чтобы выяснить потенциал защитного действия меда за счет его противогрибкового действия и снижения хронических заболеваний, связанных с питанием, таких как рак.

Для достижения этой цели мы изучили in vitro , влияние меда на рост грибов и образование микотоксинов с помощью Aspergillus в пищевых продуктах.Кроме того, мы изучили влияние меда in vivo в присутствии микотоксина на эндогенные пробиотические бактерии толстой кишки, микробные ферменты толстой кишки, пролиферацию клеток и генотоксичность.

Методы

Моноцветный мед (хлопок) был приобретен в Центре исследований пчеловодства Министерства сельского хозяйства, Каир, Египет. Арахис ( Archis hypogalal ) с повреждениями и наблюдаемым загрязнением грибами был получен из источников основного поставщика арахиса в Египте. Бактериальная культура, среда deMann, Rogosa, Sharpe (MRS) (Oxoid, Hampshire, United Kingdom) для Lactobacilli.Триптонно-фитоновые дрожжи (TPY), среда (Oxoid) для бифидобактерий. Стандарт охратоксина А (каталожный № 01877) был приобретен у химической компании Sigma-Aldrich (Сент-Луис, США). Грибы, продуцирующие афлатоксины и охратоксин А, A. parasiticus (FRR 2748) и A. ochraceus (NRRL 3174) были получены от Ассоциации стандартов Австралии (Северный Сидней, Новый Южный Уэльс, Австралия). Природные афлатоксины (B 1 , B 2 , G 1 и G 2 ) были экстрагированы из арахиса [16], и их концентрации были определены методами тонкослойной (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). [17].

Концентрация афлатоксинов B 1 , B 2 , G 1 и G 2 из арахиса составила 211,42, 135,53, 368,10 и 99,72 мкг / кг соответственно. Полученный экстракт растворяли в 2-литровом соевом масле и хранили в холодильнике до использования.

Изучение влияния меда на продукцию микотоксинов

A. parasiticus (FRR 2748) и A. ochraceus (NRRL 3174) культивировали на картофельном агаре с декстрозой в течение 10 дней при 25 ° C, пока они не стали хорошо спорулированными.Споры собирали в 10 мл стерильного 1% раствора Твина 80 (об. / Об.) С получением 10 5 спор / мл. Колбы, содержащие 500 мл среды дрожжевой экстракт-сахароза (ДА) с добавлением нулевого, 32 и 48% меда, инокулировали 2,0 мл этой суспензии, инкубировали при 28 ° C в течение 21 дня, а затем анализировали на афлатоксины [18,19].

Изучение влияния меда на прием микотоксинов мышами

Сорок два самца швейцарских мышей-альбиносов возрастом примерно 7 недель и весом 20 ± 3 г были получены из колонии приюта для животных Национального исследовательского центра, Каир, Египет.Животных содержали индивидуально в клетках из нержавеющей стали при контролируемой температуре (24–26 ° C), влажности (40–70%) и условиях освещения (12-часовой цикл свет / темнота) и позволяли свободный доступ к дистиллированной воде и основной диете (AIN- 93 М) на 10 дней в качестве адаптивного периода. Порошок AIN-93 M содержал белок (14%), крахмал (62,07%), сахарозу (10%), жир (4%), клетчатку (5%), минеральную смесь (3,5%), смесь витаминов (1%). ), L-цистин (0,18%), битратрат холина (0,25%) и тетрабутилгидрохинон (0,00008%) [20].

Затем мышей случайным образом разделили на шесть групп (по 7 животных в каждой). Группа 1 st получала диету AIN-93 M и вводила охратоксин A (10 нг / кг массы тела / день, группа ОТ). Группа 2 и группа лечились так же, как и группа 1, за исключением того, что она получала мед / диету AIN-93 M (группа HOT). Группе 3 (AT) и H (HAT) скармливали диету AIN-93 M и мед / AIN-93 M, соответственно, и вводили смесь афлатоксинов (1 мкг / кг массы тела / день). Группы 5 (NTC) и 6 (HTC) служили контролем и получали рацион AIN-93 M и медовый AIN-93 M соответственно.Эксперимент проводился в течение 2 месяцев, и животных еженедельно взвешивали для расчета суточной дозы. Животным внутрибрюшинно вводили 0,5 мл 0,05% колхицина за 2 часа до умерщвления, чтобы задержать клетки костного мозга и сперматоциты в стадии метафазы после голодания в течение ночи. Содержимое слепой кишки собирали в чистые пробирки Эппендорфа. Бедро, печень, почки, селезенка, легкие, яички и мозг были удалены.

Активность микробных ферментов толстой кишки

Активность бактериальной β-глюкуронидазы определяли в пищеварении содержимого слепой кишки с помощью P-нитрофенил-β-D-глюкуронида (Fluka, продукт No.73677) [21]. Разведение слепой кишки проводили при 4 ° C. Реакционная смесь содержала 0,3 мл раствора субстрата (5 моль P-нитрофенил-β-D-глюкуронида / л) и 0,2 мл разбавленной слепой кишки (1 часть слепой кишки и 2 части фосфатного буфера pH 6,4, мас. / Об.) И хорошо перемешивалась. , инкубировали при 37 ° C / 48 часов. Концентрацию высвободившегося п-нитрофенола измеряли от до оптического поглощения при 400 нм после добавления 2,5 мл 0,1 н. NaOH для остановки реакции. Активность фермента выражали как образовавшийся молярный продукт / г содержимого слепой кишки.

Исследование хромосомных аберраций

Хромосомы были приготовлены, окрашены 5% красителем Гимза в фосфатном буфере (pH 6,8), и 50 метафазных спредов были проанализированы на каждое животное на предмет хромосомных аберраций в клетках костного мозга [22]. Также были исследованы хромосомные аберрации в половых клетках семенников тех же животных [23].

Гистопатологическое исследование

Биопсии печени, почек, селезенки, легких и мозга фиксировали в 10% забуференном растворе формалина в течение 12 часов и превращали в парафиновые блоки.Срезы ткани толщиной 5 мм вырезали на предметных стеклах с альбумином и окрашивали гематоксилином и эозином (Hx. & E.). Для правильной оценки фиброза ткани и лучшей демонстрации кровеносных сосудов в срезах ткани также использовалось окрашивание трихромом Массона [24].

Исследования пробиотических бактерий толстой кишки

Подсчитывали эндогенные популяции пробиотических бактерий толстой кишки (лактобациллы и бифидобактерии). В конце эксперимента у каждого животного собирали образцы содержимого слепой кишки.Образцы содержимого слепой кишки немедленно (в течение 30 минут) помещали в сосуд для анаэробов и хранили при 4 ° C до анализа (максимум 6 часов). 100-кратные серийные разведения проводили в предварительно восстановленном растворе Рингера, содержащем 0,5% цистеина. Чашки Петри с различными средами инокулировали и инкубировали в течение 72 часов при 37 ° C в анаэробной атмосфере с использованием Gen Kits в сосудах Oxoid. Бактерии были обнаружены на следующих селективных средах: среда deMan, Rogosa, Шарпа (MRS) (Oxoid, Hampshire, Великобритания) для лактобацилл и среда триптон-фитоновых дрожжей (TPY) (Oxoid) для бифидобактерий.После инкубации подсчитывали колонии. Количество бактерий выражается как log 10 колониеобразующих единиц (log 10 КОЕ / г) свежего образца содержимого слепой кишки с пределом обнаружения 3,30 log 10 КОЕ / г.

Статистика

Все данные были выражены как среднее ± стандартная ошибка (SEM) среднего и проанализированы с помощью одностороннего дисперсионного анализа ANOVA с использованием статистической программы SAS (SAS версия 6.11, SAS Institute, Кэри, Северная Каролина). В случае значимости для сравнения различий между средними значениями использовали критерий множественного диапазона Дункана.Уровни значимости были проверены.

Результаты

Влияние меда на продукцию микотоксинов

Исследования in vitro показали, что биомасса A. parasiticus была увеличена в среде, содержащей 32% меда. Однако биомы A. ochraceus были уменьшены в среде, содержащей 32 и 48% меда. Охратоксин А не производился ни при одной концентрации меда. С другой стороны, производство афлатоксинов B 1 , B 2 , G 1 и G 2 увеличивалось в среде, содержащей 32% меда, но снижалось в среде с высокой концентрацией меда без образования афлатоксина B 2 и G 2 (таблица).Как правило, мы не обнаружили положительной связи между массой мицелия и производством микотоксинов.

Таблица 1

Влияние меда на массу мицелия и концентрацию микотоксинов.

FRR 106022 10,60 228
Мед% Масса мицелия (г) Концентрация микотоксинов (мкг / л)

FRR 2748

B1 B2 G1 G2 71 14,69 12,69 8,99 7,70 5,00 32,03
32,15 40,40 13,60 15,00 15,00 30,00 10,00 5,80 00,00 1,18 00,00 00,00

Влияние меда на активность глюкуронидаз толстой кишки

Влияние пробиотических β-бета-глюкуронидаз на активность эндогенных бактерий толстой кишки содержимое слепой кишки представлено в таблице.Уровень глюкуронидазы был очень низким, и достоверных различий в его содержании в слепой кишке между всеми группами не наблюдалось (P <0,05).

Таблица 2

Влияние различных обработок микотоксинами и медом на активность бактериальных глюкуронидаз в содержимом слепой кишки мышей.

9022 9022 9022 9022 9022 9022 9022 .39 ± 0,11
β-глюкуронидазы мкмоль / г Группы

OT HOT AT 0,40 ± 0,12 0,32 ± 0,10 0,37 ± 0,10 0,38 ± 0,14 0,42 ± 0,13

Генотоксические эффекты микотоксинов на клетки костного мозга

Настоящее исследование введение афлатоксинов (B 1 , B 2 , G 1 и G 2 ) и охратоксина А самцам мышей вызвало структурные и численные хромосомные аберрации (таблица и рисунок).

Таблица 3

Средние значения различных типов хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей-самцов, получавших охратоксин А и афлатоксины (B 1 , B 2 , G 1 и G 2 ).

9022 Дезинфекция 9228
Обработанные группы Числовые аберрации Структурные аберрации

Перидиплоидия
OT 2,50 ± 0,45 a 0,67 ± 0,17 a 0.67 ± 0,21 a 0,83 ± 0,17 b 2,50 ± 0,00 a 0,83 ± 0,21 a 5,50 ± 0,31 b
HOT 0,50 ± 0,00 a 0,50 ± 0,00 a 0,50 ± 0,00 b 0,83 ± 0,21 b 0,67 ± 0,17 a 3,0004
AT 2.83 ± 0,67 a 0,67 ± 0,017 a 0,67 ± 0,17 a 4,33 ± 1,31 a 1,17 ± 0,21 b 0,83 ± 0,21 0,83 ± 0,21 0,83 ± 0,21 ± 0,48 a
HAT 2,50 ± 0,36 a 0,50 ± 0,00 a 0,50 ± 0,00 a 0,67 ± 0,17 b 1.00228 0.50 ± 0,00 a 3,17 ± 0,21 c
NTC 2,00 ± 0,22 a 0,50 ± 0,00 a 0,50 ± 0,00 0,50

27

0,50 ± 0,00

24

24

27 б

0,83 ± 0,21 б 0,50 ± 0,00 а 2,83 ± 0,21 в
HTC 2,00 ± 0,34 а 0,508 0,50 .50 ± 0,00 a 0,50 ± 0,00 b 0,67 ± 0,17 b 0,50 ± 0,00 a 2,67 ± 0,17 c

мужских спредов охратоксин А и афлатоксины, показывающие: а) ослабление центромеры. б) удаление. В) разрыв хроматиды (маленькая стрелка), фрагмент (большая стрелка) клеток костного мозга и г) полиплоидия. д) аутосомно-однолистный. F) x-y одновалентных клеток сперматоцитов.

Структурные хромосомные аберрации регистрировались в виде хроматидных разрывов, хроматидных разрывов (рисунок), центромерных аттенуаций (рисунок), делеций (рисунок) и фрагментов (рисунок). В таблице представлены средние значения различных структурных хромосомных аберраций, индуцированных микотоксинами в клетках костного мозга мышей-самцов. Результаты показывают низкую частоту хроматидных промежутков, разрывов и фрагментов, тогда как частота центромерного ослабления была значительно высокой между группой AT и группой HAT с одной стороны и между группой AT и контрольными группами (NTC и HTC) с другой стороны.

Значительная разница (P <0,05) была также обнаружена в делециях (рисунок) между группой OT и группой HOT, а также между группой OT и контрольными группами (NTC и HTC), что можно отнести к защитному эффекту меда.

Значительное увеличение (P <0,05) частоты общих структурных хромосомных аберраций было обнаружено между группой OT и группой HOT с одной стороны и между группой OT и контрольными группами (NTC и HTC) с другой стороны. Также была обнаружена значительная разница между группой AT по сравнению с группой HAT и контрольными группами (NTC и HTC), соответственно.

Генотоксическое действие микотоксинов на половые клетки (сперматоциты)

Результаты нашего исследования показали, что пероральное лечение охратоксином А и афлатоксинами (B 1 , B 2 , G 1 и G 2 ) индуцировало численные и структурные хромосомные аберрации в половых клетках мышей-самцов (таблица). Численные аберрации регистрировались как перидиплоидия (n ± 1 или n ± 2) и полиплоидия (рисунок). Перидиплоидия, наблюдаемая в сперматоцитах мышей-самцов, четко различалась (p ≤ 0.5) только в группе, получавшей афлатоксины (AT), по сравнению с контрольными группами (NTC и HTC). Однако полиплоидия, индуцированная группой, обработанной охратоксином А (OT), значительно отличалась (P <0,05) по сравнению с контрольными группами. Между тем, общие числовые аберрации значительно различались (P <0,05) как в группе, получавшей охратоксин А (группа ОТ), так и в группе, получавшей афлатоксины (AT), по сравнению с контрольными группами (NTC и HTC). Защитный эффект меда проявился только в группе HAT.

Таблица 4

Средние значения различных типов хромосомных аберраций в клетках сперматоцитов мышей-самцов, получавших охратоксин А и афлатоксины (B 1 , B 2 , G 1 и G 2 ).

9rax 9034 Обработка с помощью A 9034 высокоиндуцированные структурные хромосомные аберрации, особенно униваленты xy (рисунок), где значительная разница (P <0.05) была обнаружена между группами OT и HOT, а также между группами OT и контрольными группами (HTC).

Влияние меда на пролиферацию клеток

При микроскопическом исследовании контрольной ткани печени были обнаружены гексагональные печеночные дольки, состоящие из центральной вены, из которой были видны печеночные канатики, синусоиды, выстланные излучающими клетками Купфера, а также желчные каналы. Портальный тракт располагался между тремя долями печени и состоял из воротной вены, печеночной артерии и желчного протока (рисунок).

Печень группы НТК. Нормальная ткань печени (H x. И E. × 100).

Введение охратоксина А повлияло на ткань печени, так как оно вызвало расширенные и застойные центральные вены с выраженным синусоидальным расширением, застоем и гиперпластическими купферовыми клетками (рисунок). Также был очевиден очаговый некроз печени, преимущественно периваскулярный (рисунок). Введение меда с охратоксином А не выявило положительного эффекта, так как печень в группе АОТ была поражена так же, как и в группе ОТ. С другой стороны, введение афлатоксинов вызвало мутный отек в гепатоцитах, обширные вариабельные боковые некротические области, поражающие паренхиму печени и инфильтрованные нейтрофилами и макрофагами (рисунок).Также были очевидны перегруженность расширенных центральных вен и выраженная синусоидальная дилатация с гиперплазией хупферовских клеток (рисунок). Портальные тракты утолщены мононуклеарными воспалительными клетками, образованными в основном лимфоцитами и телеангиэктатическими, перегруженными сосудистыми каналами (рисунок).

Печень ОТ группы. Расширенные, застойные центральные вены отмечали расширение и гиперемию синус-дуги (Hx. И E. × 200).

Печень ОТ группы. Очаговый некроз печени преимущественно перисосудистый (Hx.И E. × 200).

Печень группы АТ. Некротические участки паренхимы печени, инфильтрованные нейтрофилами (Hx. & E. × 100).

Печень группы АТ. Застойные расширенные центральные вены и выраженная синусоидальная дилатация (Hx. И E. × 400).

Печень группы АТ. Портальные тракты утолщены за счет заметной дилатации и закупорки сосудистых каналов и умеренного воспалительного инфильтрата мано-ядерной области (Hx. И E. × 400).

Гистопатологическое исследование контрольных тканей почек показало клубочки, проксимальные и дистальные извитые почечные канальцы, в мозговом веществе находились собирательные канальцы и части восходящей и нисходящей петли курицы.Введение охратоксина А вызывало мутное набухание проксимальных извитых канальцев, фибриновый тромбин в петлях клубочковых капилляров, увеличение количества и размера клубочков (рисунок), а также интерстициальный фиброз и скопление (рисунок). С другой стороны, совместное введение меда с охратоксином А улучшило действие охратоксина А на почки, где сосудистая полость нормализовалась. Однако они все же были немного увеличены (рисунок). Введение афлатоксинов вызывало мутный отек эпителиальной выстилки почечных канальцев с легким интерстициальным фиброзом и застоем (рисунок).

Почка ОТ группы. Увеличение количества и размера клубочков (Hx. И E. × 100).

Почка ОТ группы. Интерстициальный фиброз и гиперемия (трихром Massons × 100).

Почка группы HOT. Вернитесь к норме, за исключением заложенности сосудов (Hx. И E. × 200).

Почка группы АТ. Мутное набухание эпителия канальцев (Hx. & E. × 100).

Что касается воздействия охратоксина на мозг, гистологическое исследование показало наличие очагов дегенерации (рисунок), тогда как совместное введение меда с охратоксином А улучшило этот эффект.Кроме того, введение афлатоксина не вызывало каких-либо изменений в мозговой ткани.

Мозг. Очаги дегенерации в группе ОТ (Hx. & E. × 100).

Гистопатологическое исследование контрольного легкого показало тонкие альвеолярные стенки, состоящие из эпителиальных клеток с обеих сторон центрально расположенных капилляров без промежуточной стромы соединительной ткани. Введение охратоксина А повлияло на ткани легкого, где в легком наблюдались отек, застой, лимфоидные агрегаты в интерстициальной ткани (рисунок).Результаты показали, что легкое облегчило застойные явления (одновременный прием меда с охратоксином А) (рисунок). Принимая во внимание, что легкие показали интерстициальный фиброз и воспалительный инфильтрат после введения афлатоксина (рисунок).

Легкое группы ОТ. Отек, гиперемия, лимфоидные скопления интерстициальной ткани (Hx. И E. × 100).

Легкое группы HOT. Облегчение отека, но отек и лимфоцитарные агрегаты все еще присутствуют (Hx. И E. × 100).

Легкое группы АТ.Показан интерстициальный фиброз, воспалительное заполнение очаговыми лимфоцитарными агрегатами (трихром Massons × 100).

Контрольная ткань селезенки показала каркас соединительной ткани (который включает капсулу, трабекулы и ретикулярную соединительную ткань) и паренхиму лимфоидной ткани в виде белой (лимфоидные узелки) и красной пульпы (рисунок). На рисунке проиллюстрировано влияние охратоксина А на селезенку, где показано расширение белой пульпы с разрушением нормальной архитектуры, адвентициальное утолщение артериол, адвентициальное утолщение артериол, очаговый фиброз красной пульпы и сжатие синусоидов.

Селезенка группы NTC. Вызваны аналогичные гистопатологические, бело-красные пульпы. (Hx. И E. × 100).

Селезенка группы ОТ. Расширение белой пульпы с облитерацией нормальной архитектуры (Hx. & E. × 100).

С другой стороны, введение афлатоксинов не показало никаких изменений в ткани селезенки. Совместное введение меда с афлатоксинами вызывает улучшение всех гистопатологических изменений, которые произошли во всех исследованных органах, кроме ткани почек.

Влияние меда на пробиотические бактерии толстой кишки

Добавление меда к порошковой диете AIN-93 M (группа HTC) увеличивало количество бифидобактерий в среднем на 2,3 ± 0,23 log 10 КОЕ / г (p <0,004) и lactobacilli в среднем на 1,07 ± 0,35 log 10 КОЕ / г (p <0,016) по сравнению с группой NTC (таблица).

Таблица 5

Влияние меда и микотоксинов на рост LAB (log 10 КОЕ / г).

Обработанные группы Численные аберраций Структурные аберрации

Peridiploidy полиплоидия Итого XY унивалентов аутосомно унивалентов Итого
OT 1,75 ± 0,48 ab 3,75 ± 0,48 a 5,25 ± 0,48 a 2.75 ± 0,48 а 1,00 ± 0,41 а 3,75 ± 0,86 а
ГОРЯЧИЙ 1,50 ± 0,29 abc 2,75 ± 0,25

8

2,75 ± 0,25

8

1,00 ± 0,41 b 0,75 ± 0,25 a 1,75 ± 0,63 a
AT 2,25 ± 0,25 a 1,2550 ± 0,29 b 2,00 ± 0,92 ab 0,75 ± 0,75 a 2,75 ± 0,95 a
HAT 1,50 ± 0,29

228c

2,00 ± 0,0,41 1,50 ± 0,29 ab 0,50 ± 0,29 a 2,00 ± 0,58 a
NTC 0,75 ± 0,48 9000 0,75 ± 0,48 9000 .41 b 1,50 ± 0,29 c 1,50 ± 0,29 ab 1,00 ± 0,41 a 2,50 ± 0,29 a
a
9 0228 0,25 ± 0,25 b 1,00 ± 0,41 c 1,00 ± 0,14 b 1,00 ± 0,00 a 2,00 ± 0,00 a
Штаммы Группы мышей

OT HOT AT HAT 9028 3.26 ± 0,19 3,83 ± 0,20 Нет Нет 5,00 ± 0,15 6,06 ± 0,22
Бифидобактерии
3,73 ± 0,19 9022 9022 3,73 ± 0,19 9022 3,77 ± 0,22 6,26 ± 0,29 8,57 ± 0,24

Введение охратоксина А в группу, получавшую мед (группа HOT), увеличило количество лактобактерий в среднем на 0,75 ± 0.15 log 10 КОЕ / г (p <0,108) по сравнению с группой ОТ. Лактобациллы не обнаруживались при введении афлатоксинов (группы HAT и AT) (таблица).

Введение смеси охратоксина А и афлатоксинов в присутствии меда (группы HOT и HAT) увеличило среднее количество бифидобактерий на 1,03 ± 0,32 log 10 КОЕ / г (p <0,083) и 0,57 ± 0,50 log 10 КОЕ / г (p <0,219) по сравнению с группами ОТ и АТ соответственно.

Обсуждение

Влияние меда на продукцию микотоксинов

Наши результаты показывают, что влияние меда на биомассу и образование микотоксинов ( in vitro, ) зависело от вида грибов ( A.parasiticus и A. ochraceus ) и концентрации меда. Об антимикробных свойствах перекиси водорода и неперекисных компонентов меда сообщалось в нескольких исследованиях [25]. Таким образом, для этих 2 типов грибов мед нейтрализовал больше патогенов дозозависимым образом, чем контрольный сахарный раствор (80%), состоящий из фруктозы и глюкозы, аналогично чистому меду [25]. Неразбавленный мед полностью подавлял рост обычных грибов поверхностной инфекции и заражения ран ( Aspergillus fumicgatus, A flavus, Penicellum citrinum, Trichophyton rubrum и Candida albicans ), частичное подавление с концентрацией меда 50% и отсутствие подавления было зарегистрировано концентрация меда 20% [26].

Влияние меда на пробиотические бактерии толстой кишки

Лактобациллы и бифидобактерии имеют сложные пищевые потребности, такие как углеводы, аминокислоты, пептиды, сложные эфиры жирных кислот, соли, производные нуклеиновых кислот и витамины, которые сильно различаются от вида к виду. Мед содержит более 180 веществ, в том числе аминокислоты, витамины, минералы и ферменты [5]. Основными углеводными составляющими меда являются фруктоза (32,56%) и глюкоза (28,54%). Помимо олигосахаридов (1.От 58 до 3,77% мальтозы, 0,78 ± 2,03% туранозы, 1,11 ± 2,81% нигерозы, 0,05 ± 0,15% мели-биозы, 0,03 ± 0,08% панозы, 0,24 ± 1,03% мальтотриозы, 0,21 ± 0,37% мелецитозы и 0,10 ± 0,25%. Мед также содержит от 4 до 5% фруктоолигосахаридов, которые служат пробиотическими агентами [4].

Нормальная слизистая оболочка тонкой кишки человека может не полностью поглощать фруктозу. Несколько исследований показали, что распространенность мальабсорбции фруктозы у здоровых взрослых может достигать 30–50%, эти субъекты могут нарушать всасывание заметного количества 25 г фруктозы [27].Наиболее нормальные субъекты мальабсорбируют около 10% углеводов, содержащихся в меде [28]. Олигосахариды меда с низкой степенью полимеризации считаются благоприятным субстратом для бифидобактерий [10]. Наконец, неперевариваемые и / или неабсорбируемые сахариды перемещаются в толстую кишку, чтобы вызвать селективную ферментацию и селективную стимуляцию роста и активности пробиотических бактерий в толстой кишке, как было обнаружено ранее [29].

Настоящее исследование подтверждает имитирующий эффект меда на пробиотические бактерии толстой кишки.Рост кишечных Bifidobacteria spp. был усилен наличием более чем лактобацилл, что может быть связано с олигосахаридами меда с низкой степенью полимеризации (от 4 до 5%).

Уменьшение количества пробиотических бактерий толстой кишки при введении микотоксина и в отсутствие или в присутствии меда может быть связано с изменениями бактериальной поверхности во время фазы роста в результате связывания микотоксинов [13].

Влияние меда на активность бактериальных ферментов толстой кишки

Уровень глюкуронидаз является важным показателем влияния диеты на состав и активность кишечной микрофлоры.Он участвует в образовании, а также в инактивации канцерогенов в просвете кишечника и может быть положительно изменен присутствием пробиотических бактерий толстой кишки [30].

Антигенотоксические эффекты меда

Было обнаружено, что микотоксины генотоксичны для костного мозга и клеток сперматоцитов мышей, что совпадает с предыдущими сообщениями [31,32] о том, что охратоксин А и афлатоксины вызывали хромосомные аберрации во многих клетках млекопитающих (мыши , крыса, китайский хомяк и даже человек).

Используя смесь охратоксина А и афлатоксинов в качестве токсичных и канцерогенных веществ, мы охарактеризовали потенциальную антигенотоксичность меда. Мед был антигенотоксичным ( in vivo ), и этот эффект зависел от пробиотических бактерий толстой кишки и других факторов. Предполагается, что пробиотические бактерии толстой кишки обладают несколькими полезными эффектами, включая инактивацию канцерогенов [15]. Помимо открытия, что пробиотические бактерии толстой кишки обладают антигенотоксическими свойствами, непосредственный интерес представляет изучение механизмов, ответственных за их защиту.Было высказано предположение, что белковая структура липополисахаридной мембраны бактерий может быть эффективным компонентом [33]. Кроме того, было несколько сообщений о том, что молочнокислые бактерии (LAB) могут связывать мутагены и, таким образом, могут снижать мутагенность [34].

Пищевые факторы, содержащиеся в меде, можно использовать для предотвращения и устранения мутации, вызванной афлатоксинами [35]. Это соответствовало нашим выводам, которые показали, что можно предотвратить или уменьшить хромосомные аберрации, вызванные афлатоксинами.Кроме того, вызванное AFB1 повреждение ДНК и хромосомные аберрации в клетках грызунов и человека могут регулироваться множеством факторов, включая питательные вещества и химиопрофилактические агенты [36]. Это согласуется с нашими результатами, согласно которым прием меда может улучшить генетический материал и минимизировать хромосомные аберрации, вызванные микотоксинами.

Влияние меда на пролиферацию клеток

Настоящие результаты гистопатологического исследования показали, что охратоксин А вызывает кровотечение и некроз красной пульпы селезенки.Этот вывод соответствует работе [30]. Кроме того, некроз белой пульпы затронул корковые и мозговые области лимфоидных фолликулов. Кроме того, охратоксин А связан с нарушением структуры и функции клеточной мембраны мозга [31]. Он может заметно увеличивать активность цитозольных и лизосомальных ферментов.

В настоящем исследовании влияние афлатоксинов на печень согласуется с ранее проведенной работой [32], которая объяснила это влияние увеличением цитоплазматической легкости и потерей цитоплазматической зернистости гепатоцитов.Также были зарегистрированы периоптальный фиброз с дегенерацией и изъязвлением желчных дуэтов, выстилающих эпителиальные клетки, и пролиферация желчных протоков [33]. Были очевидны мультифокальные, случайно распределенные области некроза печени, инфильтрованные нейтрофилами и макрофагами. Поражения были центральными, более выраженными вокруг портала и аналогичным результатом [34]. Результаты настоящей работы согласуются с ранее опубликованными [35] о том, что у крыс, получавших внутрибрюшинную инъекцию афлатоксина B 1 , наблюдалась выраженная воспалительная реакция в легких, застой, разрушение альвеолярных стенок с амфизематозными изменениями и утолщение стенки кровеносных сосудов, возникающие в пятнистых участках легочной ткани.

На основании гистопатологического исследования можно сделать вывод, что добавление меда к охратоксину А лишь немного улучшило микроскопические изменения почечной ткани. Однако добавление афлатоксинов к меду улучшило гистопатологические изменения, вызванные токсином, в различных органах, за исключением ткани почек.

Наши результаты показали, что вредное воздействие микотоксинов может быть уменьшено в присутствии меда, что может быть связано с детоксикацией микотоксинов пробиотическими бактериями.В то же время доступность связанного AFB1 с антителом предполагает, что поверхностные компоненты этих бактерий участвовали в связывании токсина [13]. Изменение температуры (от 4 до 37 ° C) и pH (от 2 до 10) не оказало значительного влияния на количество высвобождаемого AFB1. Связывание AFB1, по-видимому, является преимущественно внеклеточным для жизнеспособных и подвергнутых термической обработке бактерий. Однако обработка кислотой может разрешить внутриклеточное связывание. Во всех случаях связывание обратимо, но стабильность образующихся комплексов зависит от штамма, обработки и условий окружающей среды.Как правило, отделение AFB1 от бактериальной поверхности требует времени. В течение этого времени AFB1 выполняет запись вдоль желудочно-кишечного тракта в направлении изгнания. Эта секвестрация AFB1 снижает возможность его реабсорбции или оказания патогенного воздействия на энтероциты или лимфоидную ткань, ассоциированную с кишечником (GALT). Это может быть чистым эффектом детоксикации микотоксинов из организма. Кроме того, наши результаты совместимы с [36], так как охратоксин A демонстрирует мутное набухание проксимальных извитых канальцев в дополнение к канальцевым эозиногильным внутрипросветным цилиндрам, фибриновым тромбам в петлях клубочковых капилляров и выраженному интерстициальному фиброзу и застою.

Афлатоксины являются генотоксическими канцерогенами. Для этого типа канцерогенов обычно считается, что не существует пороговой дозы, ниже которой не могло бы произойти образование опухоли. Другими словами, только нулевой уровень воздействия не приведет к отсутствию риска. Это согласуется с недавней оценкой [37] в отношении генотоксичности афлатоксина [38]. Необходимо провести углубленные исследования, чтобы выяснить влияние фазы роста всех штаммов пробиотических бактерий на связывание AFB 1 и G 1 и других микотоксинов in vitro и in vivo .

Заключение

Настоящие результаты показывают, что мед обладает защитным действием, зависящим от его антимикробных свойств. Также мед усиливает эндогенные пробиотические бактерии толстой кишки (бифидогенные эффекты), что оказывает несколько полезных эффектов (например, детоксикация и антигенотоксичность).

Мы рекомендуем заменять сахар медом в высокой концентрации в обработанных пищевых продуктах, детских смесях, детских закусках, особенно в тех, которые изготовлены из сельскохозяйственных материалов (например,грамм. молотый горох и кукуруза), чтобы избежать роста грибов и образования микотоксинов. Согласно результатам, полученным в этой статье, доза смеси афлатоксинов, превышающая 1 мкг афлатоксинов на кг веса тела в день, оказывает выраженное вредное воздействие. Это подтверждается недавно проведенным Европейским союзом обсуждением ограничения максимально допустимого содержания афлатоксинов в пищевых продуктах.

Список сокращений

Группа ОТ — группа 1, порошковая диета AIN-93 M, получавшая и вводившая охратоксин А (10 нг / кг массы тела / день).

HOT группа -группа 2, мед, порошковая диета AIN-93 M, получавшая и вводившая охратоксин А (10 нг / кг массы тела / день).

AT группа — группа 3, порошковая диета AIN-93 M, получавшая и вводимая смесью афлатоксинов (1 мкг / кг массы тела / день).

HAT группа — группа 4, мед, порошок AIN-93 M, диета, полученная и вводимая смесью афлатоксинов (1 мкг / кг массы тела / день).

НТК группа -группа 5, АИН-93 М порошковое диетическое скармливание.

HTC group -группа 6, мед АИН-93 М порошковый диетический скармливаемый.

Конкурирующие интересы

Автор (ы) заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Вклад авторов

Али Эзз Эль-Араб задумал и спроектировал исследование и выполнил микробные ферменты толстой кишки (он также позаботился об экспериментальном животном в сотрудничестве с Шенудой Гиргисом, который исследовал хромосомные аберрации). Эман Хегази провел гистологическое исследование, а Аззат Абд эль-Халек подсчитал пробиотические бактерии. Все авторы сообщили данные и написали эту рукопись.

Благодарности

Первый автор выражает благодарность доктору Хани С. Эль-Незами, Департамент биохимии и химии пищевых продуктов, Университет Турку, 20014, Турку, Финляндия, за его лекцию о пробиотических бактериях и AFB1 в Национальном исследовании Центр, Докки, Гиза, Египет.

Ссылки

  • Саарела М., Латенмаки Л., Криттенден Р., Салминен С., Маттила-Сандхольм Т. Кишечные бактерии и здоровая пища — европейская перспектива. Intern J Food Microbiol.2000. 278: 99–117. [PubMed] [Google Scholar]
  • Verschuren PM. Функциональные продукты питания: научные и глобальные перспективы. Br J Nutr. 2002; 88: S125 – S130. DOI: 10,1079 / BJN2002675. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Bazzarre TL, Wu, SML Yuhas JA. Общие концентрации и ЛПВП после приема йогурта и кальция. Nutr Reports Intern. 1983; 28: 1225–1232. [Google Scholar]
  • Чоу Дж. Пробиотики и пребиотики: краткий обзор. J Ren Nutr. 2002; 12: 76–86. [PubMed] [Google Scholar]
  • White JW.Состав меда. В: Crane E, редактор. Мед: всеобъемлющий обзор. Лондон, Хайнеманн; 1979. С. 157–192. [Google Scholar]
  • Аль-Мамарья М., Аль-Мериб А., Аль-Хабориб М. Антиоксидантные свойства и общие фенольные соединения различных видов меда. Nutr Res. 2002; 22: 1041–1047. DOI: 10.1016 / S0271-5317 (02) 00406-2. [CrossRef] [Google Scholar]
  • Беннетт Дж. В., Клих М. Микотоксины. Обзор Clin Microb. 2003. 16: 497–516. DOI: 10.1128 / CMR.16.3.497-516.2003. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Генри Ш., Bosch FX, Troxell TC, Bolger PM.Уменьшение рака печени — глобальный контроль афлатоксина. Наука. 1999; 286: 2453–2454. DOI: 10.1126 / science.286.5449.2453. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Койпер-Гудман Т. Безопасность пищевых продуктов: микотоксины и фикотоксины в перспективе. В: Miraglia M, Van Edmond H, Brera C, Gilbert J, редактор. Микотоксины и фикотоксины — разработки в области химии, токсикологии и безопасности пищевых продуктов. Alaken Inc., Форт-Коллинз, Колорадо; 1998. С. 25–48. [Google Scholar]
  • Кадзивара С., Ганди Х., Устунол З. Влияние меда на рост и выработку кислоты кишечными бактериями Bifidobacterium spp.: in vitro Сравнение с коммерческими олигосахаридами и инулином. J food prod. 2002; 65: 214–218. [PubMed] [Google Scholar]
  • Salminen S, Bouley MC, Boutron-Rualt MC, Cummings J, Frank A, Gibson E, Isolauri E, Moreau MC, Roberfroid M, Rowland I. Наука о функциональном питании, физиология и функции желудочно-кишечного тракта. Br J Nutr. 1998; 1: 147–171. DOI: 10,1079 / BJN19980108. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Эль-Незами Х., Микнен Х., Канкаанп П., Салминен С., Ахокас Дж.Способность штаммов Lactobacillus и propionibacterium удалять афлатоксин B1 из двенадцатиперстной кишки цыпленка. J Food Prot. 2000; 63: 549–552. [PubMed] [Google Scholar]
  • Haskard CA, El-Nezami HS, Kankaanp PE, Salminen S, Aholmas JT. Поверхностное связывание афлатоксина B1 молочнокислыми бактериями. Appl Environ Microbiol. 2001; 67: 3086–3091. DOI: 10.1128 / AEM.67.7.3086-3091.2001. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Gratz S, Mykkänen H, Ouwehand AC, Juvonen R, Salminen S, El-Nezami H.Кишечная слизь изменяет способность пробиотических бактерий связывать афлатоксин B1 In Vitro . Appl Environ Microbiol. 2004. 70: 6306–6308. DOI: 10.1128 / AEM.70.10.6306-6308.2004. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Pool-Zobel BL, Neidecker C, Domizlaff I, Ji S, Schillinger U, Rumney C, Moretti I, Vilarini I, Scassellati-Sforzolini R, Rowland I. • Антигенотоксичность, опосредованная лактобактериями и бифидобактериями, в толстой кишке крыс. Nutr Cancer. 1996. 26: 365–380. [PubMed] [Google Scholar]
  • A.OAC «Официальные методы официальных химиков-аналитиков. Арлингтон, Вирджиния, США. 2000.
  • Park D, Neslein S, Trucksess MW, Starck ME, Newel RF. Метод жидкостной хроматографии для определения афлатоксинов B-1, B2, G1 и G2 в продукты из кукурузы и арахиса. J Assoc Off Anal Chem. 1990; 73: 260–266. [PubMed] [Google Scholar]
  • Haspolat K, Buyukbas S, Cengel H. In vitro антибактериальный и противогрибковый эффект меда. Turk Hijyen — Ve — Денейсел-Бийолоджи-Дергиси.1990; 47: 211–216.[Google Scholar]
  • Wahdan HA. Противомикробный эффект меда. Египетская J Lab Med. 1996; 8: 29–44. [Google Scholar]
  • Ривз П., Нильсен Ф., Фэи Г. Очищенные диеты AIN-93 для лабораторных грызунов: заключительный отчет специального комитета по написанию Американского института питания о разработке рациона для грызунов AIN-76A. J Nutr. 1993; 123: 1939–1951. [PubMed] [Google Scholar]
  • Djouzi Z, Andrieux C. Сравнивали эффекты трех олигосахаридов на метаболизм кишечной микрофлоры у крыс, привитых фекальной флорой человека.Br J Nutr. 1997; 78: 313–324. DOI: 10,1079 / BJN19970149. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Preston RJ, Dean BJ, Galloway S, Holden H, McFee AF, Shelby M. Mammalian in vivo цитогенетический анализ . Mutat Res. 1987. 189: 157–165. DOI: 10.1016 / 0165-1218 (87) -8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Руссо А. In vivo цитогенетика: половые клетки млекопитающих. Mutat Res. 2000; 455: 167–189. [PubMed] [Google Scholar]
  • A.F.I.P. Институт патологии Вооруженных Сил.Лабораторные методы в гистотехнологии. Вашингтон; 1994. [Google Scholar]
  • Wahdan HAL. Причины антимикробной активности меда. Заразить. 1998; 26: 26–30. [PubMed] [Google Scholar]
  • Efem SEE, Udoh KT, Lwara CI. Антимикробный спектр меда и его клиническое значение. Заразить. 1992. 20: 277–285. [Google Scholar]
  • Мишкин Д., Саблаускас Л., Яловский М., Мишкин С. Нарушение всасывания фруктозы и сорбита у амбулаторных пациентов с функциональной диспепсией: сравнение с нарушением переваривания / нарушением всасывания лактозы.Dig Dis Sci. 1997. 42: 2591–2596. DOI: 10.1023 / А: 1018841402133. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Ladas SD, Raptis SA. Мед, абсорбция фруктозы и слабительный эффект. J Nutr. 1999; 15: 591–592. DOI: 10.1016 / S0899-9007 (99) 00092-1. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Цимер С.Дж., Гибсон Г.Р. Обзор пробиотиков, пребиотиков и синбиотиков в концепции функционального питания: перспективы и будущие стратегии. Int Dairy Journal. 1998. 8: 473–479. DOI: 10.1016 / S0958-6946 (98) 00071-5.[CrossRef] [Google Scholar]
  • Налини Н., Манджу В., Менон В.П. Влияние кокосового жмыха на активность бактериального фермента при раке толстой кишки, вызванном 1,2-диметилгидразином. Clin Chim Acta. 2004; 342: 203–210. DOI: 10.1016 / j.cccn.2004.01.001. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Groose Y, Chekir-Ghedira L, Huc A, Obrecht-Pflumio S, Dirheimer G, Bacha H, Pfohl-Leszkowicz A. Сетчатка, аскорбиновая кислота и альфа-токоферол предотвращают образование аддуктов ДНК у мышей, получавших микотоксины охратоксин А и зеараленон.Раковый латыш. 1997. 114: 255–229. DOI: 10.1016 / S0304-3835 (97) 04676-4. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Wang JS, Groopman JD. Повреждение ДНК микотоксинами. Mutat Res. 1999; 424: 167–81. [PubMed] [Google Scholar]
  • Zhang XB, Ohta Y. Антимутагенность клеточных фракций микроорганизмов в отношении сильнодействующих мутагенных пиролизатов. Mutat Res. 1993; 298: 247–253. DOI: 10.1016 / 0165-1218 (93)

    -V. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Эль-Незами Х., Канкаанпаа П., Салминан С., Ахокас Дж. Способность молочных штаммов молочнокислых бактерий связывать общий пищевой канцероген, афлатоксин B1.Food Chem Toxicol. 1998. 36: 321–326. DOI: 10.1016 / S0278-6915 (97) 00160-9. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Шарманов Т.Ш., Ников П.С., Алдабергенова К.У., Меербекова Б.Т. Влияние типа питания и афлатоксина B1 на структуру хромосом. Вопр Питан. 1986; 5: 56–60. [PubMed] [Google Scholar]
  • Munro IC, Scott PM, Moodie CA, Willes RF. охратоксин Возникновение и токсичность. J Am Vet Med Assoc. 1973; 63: 1269–1273. [PubMed] [Google Scholar]
  • Monnet-Tschudi F, Sorg O, Honegger P, Zurich M, Hugget AC, Schilter B.Влияние встречающегося в природе пищевого микотоксина хроматоксина А на клетки мозга в культуре. Нейротоксикология. 1997; 18: 831–840. [PubMed] [Google Scholar]
  • Кларк Д., Джаир А.В., Хэтч Р. Влияние различных видов лечения на индуцированный хронический афлатоксикоз у кроликов. Am J Vet Res. 1982; 43: 106–110. [PubMed] [Google Scholar]
  • Эль-Захан Х., Эль-Ашри М.А., Тарват Е.Е., Саад М.М., Амин С.О. Кролик и афлатоксины: влияние смеси афлатоксинов на кровь, компоненты плазмы природы Новой Зеландии, штамбы белого кролика.Египетский кролик J Sci. 1996; 6: 55–56. [Google Scholar]
  • Уэно Ю. Токсикология микотоксинов. CRC Crit Rev Toxicol. 1985. 14: 99–132. [PubMed] [Google Scholar]
  • Gopuiath C, Prentic DE, Lewis DJ. Атлас экспериментальной токсикологической патологии. Current, гистопатология, MTP press limited, lan coraster, Boston The Hague-Derdecht. 1987. 30: 43–61. [Google Scholar]
  • Albassam MA, Yong SI, Bhatnagar R, Sharma AK, Prior MG. Гистопатологические и электронно-микроскопические исследования острой токсичности охратоксина А у крыс.Vet Pathol. 1987. 24: 427–435. [PubMed] [Google Scholar]

Влияние диетического меда на микрофлору кишечника и токсичность микотоксинов у мышей

BMC Complement Altern Med. 2006; 6: 6.

, 1 , 2 , 3 и 4

Али М Эзз Эль-Араб

1 Департамент пищевых наук и питания, Национальный исследовательский центр, 12644 — Докки, Гиза, Египет

Шенуда М. Гиргис

2 Департамент клеточной биологии, Национальный исследовательский центр, 12644 — Докки, Гиза, Египет

Эман М. Хегази

3 Департамент пищевой токсикологии, Национальный исследовательский центр, 12644 — Докки, Гиза, Египет

Аззат Б. Абд Эль-Халек

4 Департамент молочных продуктов, Национальный исследовательский центр, 12644 — Докки, Гиза, Египет

1 Департамент пищевых наук и питания Национального исследовательского центра, 12644 — Докки, Гиза, Египет

2 Департамент клеточной биологии, Национальный исследовательский центр, 12644 — Докки, Гиза, Египет

3 Департамент пищевой токсикологии, Национальный исследовательский центр, 12644 — Докки, Гиза, Египет

4 Департамент молочных продуктов, Национальный исследовательский центр, 12644 — Докки, Гиза, Египет

Автор, отвечающий за переписку.

Поступило 20 февраля 2005 г .; Принято 14 марта 2006 г.

Copyright © 2006 Ezz El-Arab et al; лицензиат BioMed Central Ltd.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе. при условии правильного цитирования оригинала.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Фон

Пчелиный мед — это функциональный корм, обладающий уникальным составом, антимикробными свойствами и бифидогенным действием.Настоящее исследование было предпринято для того, чтобы оценить, может ли мед подавлять токсическое действие микотоксинов.

Методы

Производство биомассы и токсинов с помощью Aspergillus parasiticus и Aspergillus ochraceus исследовали в средах без меда и с медом. Хотя афлатоксины и охратоксин А вводили самцам швейцарских мышей-альбиносов в дозах до 1 мкг и 10 нг / кг массы тела / день соответственно. Подопытных животных кормили диетами без нашего 10% меда в течение двух месяцев.Следили за изменениями в пробиотических бактериях толстой кишки, детерминантном ферменте толстой кишки глюкуронидазе и генотоксичности.

Результаты

Добавление 32% в среду увеличивало биомассу A parasiticus , в то время как биомасса A. ochraceus уменьшалась, и охратоксин A. не производился. Когда в среду добавляли мед в соотношении 32 и 48%. Связи между массой мицелия и продукцией микотоксинов не обнаружено. Пероральный прием афлатоксинов (смесь B 1 , B 2 , G 1 и G 2 ) и охратоксина А.вызывали структурные и численные хромосомные аберрации в костном мозге и половых клетках самцов мышей, тогда как лечение медом снижало генотоксичность микотоксинов. Также оба токсина вызывали гистопатологические изменения в печени и почках. Питание на диете с добавлением меда улучшило гистопатологические изменения в случае группы афлатоксинов, но не в случае группы охратоксина А. (за исключением почек в двух случаях). Не было обнаружено значительных различий в активности β-глюкуронидазы толстой кишки между группами, получавшими диету с медом или без него.С другой стороны, количество бифидобактерий толстой кишки и лактобацилл заметно увеличилось в группе, получавшей диету с добавлением меда.

Заключение

Замена сахара на мед в обработанных пищевых продуктах может подавлять вредные и генотоксические эффекты микотоксинов и улучшать микрофлору кишечника.

Общие сведения

Пищевые продукты больше не ценятся потребителями только с точки зрения их вкуса и непосредственных потребностей в питании, но также с точки зрения их способности обеспечивать определенную пользу для здоровья.Функциональные продукты питания стали важным сектором пищевых продуктов, обеспечивающим пользу для здоровья благодаря функциональным ингредиентам в этих продуктах. Функциональные продукты питания, направленные на улучшение баланса и активности кишечной среды, в настоящее время составляют самый большой сегмент рынка функциональных продуктов питания [1,2].

В течение долгого времени было замечено, что мед можно использовать для лечения заболеваний печени, сердечно-сосудистой системы и желудочно-кишечного тракта [3]. Мед — это натуральный продукт с очень сложным химическим составом. Он состоит в основном из фруктозы и глюкозы, но также содержит от 4 до 5% фруктоолигосахаридов, которые служат пребиотическими агентами [4].Он содержит более 180 веществ, в том числе аминокислоты, витамины, минералы и ферменты [5]. Антимикробные свойства перекиси водорода и неперекисных компонентов меда проверялись в нескольких исследованиях [6].

Распространенность заражения микотоксинами (афлатоксинами и охратоксинами) носит глобальный характер. По оценкам, четверть сельскохозяйственных культур в мире в той или иной степени загрязнены микотоксинами, особенно распространенными в развивающихся странах. Как правило, микотоксины обычно содержатся в пищевых продуктах [7,8].Микотоксины вызывают серьезную озабоченность из-за их пагубного воздействия на здоровье людей и животных. Aspergillus flavus и A. parasiticus продуцируют афлатоксины. Охратоксин А был открыт как метаболит Aspergillus ochraceus . Из токсинов Aspergillus только охратоксин (природный канцероген и нефротоксин) потенциально так же важен, как афлатоксины (природный канцероген). Оба они связаны как с токсичностью, так и с канцерогенностью для здоровья человека.Ведущий деятель в области оценки риска назвал микотоксины наиболее важным хроническим диетическим фактором риска, превосходящим синтетические контаминанты, токсины растений, пищевые добавки или остатки пестицидов [7,9].

Загрязняющие пищевые вещества, попадающие в организм оральным путем, напрямую подвергаются действию кишечной микрофлоры. Микрофлора желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) все чаще признается одним из факторов, влияющих на здоровье человека. Эта микрофлора представляет собой динамическое равновесие, которое может быть изменено диетой [10].Нормальная здоровая микрофлора кишечника содержит множество штаммов молочнокислых бактерий (LAB), некоторые из которых были выделены, приписаны несколько полезных эффектов и названы штаммами пробиотиков [11]. Несколько исследований показали, что пробиотические бактерии толстой кишки могут удалять микотоксины посредством физического связывания в качестве механизма удаления мутагена [12-14]. Кроме того, тяжесть отравления микотоксинами может быть усилена такими факторами, как дефицит витаминов, недостаток калорий, злоупотребление алкоголем и статус инфекционного заболевания [7].

Кроме того, есть доказательства того, что пробиотические бактерии толстой кишки могут положительно модулировать определенные микробные ферменты толстой кишки, которые могут играть роль в заболеваниях, связанных с диетой. Изменение этих параметров указывает на защитный эффект от канцерогенов. Пробиотические бактерии связывают мутагены in vitro , а также предотвращают выведение мутагенов из организма человека. Однако необходимы дополнительные исследования для определения физиологического значения эндогенных пробиотических бактерий толстой кишки [15].

Полное устранение любых естественных токсинов из продуктов питания — недостижимая цель. Наука о питании расширяет знания о том, как продукты питания влияют на потребителей в зависимости от конкретных параметров здоровья.

Следовательно, необходимо провести более глубокие исследования, чтобы выяснить потенциал защитного действия меда за счет его противогрибкового действия и снижения хронических заболеваний, связанных с питанием, таких как рак.

Для достижения этой цели мы изучили in vitro , влияние меда на рост грибов и образование микотоксинов с помощью Aspergillus в пищевых продуктах.Кроме того, мы изучили влияние меда in vivo в присутствии микотоксина на эндогенные пробиотические бактерии толстой кишки, микробные ферменты толстой кишки, пролиферацию клеток и генотоксичность.

Методы

Моноцветный мед (хлопок) был приобретен в Центре исследований пчеловодства Министерства сельского хозяйства, Каир, Египет. Арахис ( Archis hypogalal ) с повреждениями и наблюдаемым загрязнением грибами был получен из источников основного поставщика арахиса в Египте. Бактериальная культура, среда deMann, Rogosa, Sharpe (MRS) (Oxoid, Hampshire, United Kingdom) для Lactobacilli.Триптонно-фитоновые дрожжи (TPY), среда (Oxoid) для бифидобактерий. Стандарт охратоксина А (каталожный № 01877) был приобретен у химической компании Sigma-Aldrich (Сент-Луис, США). Грибы, продуцирующие афлатоксины и охратоксин А, A. parasiticus (FRR 2748) и A. ochraceus (NRRL 3174) были получены от Ассоциации стандартов Австралии (Северный Сидней, Новый Южный Уэльс, Австралия). Природные афлатоксины (B 1 , B 2 , G 1 и G 2 ) были экстрагированы из арахиса [16], и их концентрации были определены методами тонкослойной (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). [17].

Концентрация афлатоксинов B 1 , B 2 , G 1 и G 2 из арахиса составила 211,42, 135,53, 368,10 и 99,72 мкг / кг соответственно. Полученный экстракт растворяли в 2-литровом соевом масле и хранили в холодильнике до использования.

Изучение влияния меда на продукцию микотоксинов

A. parasiticus (FRR 2748) и A. ochraceus (NRRL 3174) культивировали на картофельном агаре с декстрозой в течение 10 дней при 25 ° C, пока они не стали хорошо спорулированными.Споры собирали в 10 мл стерильного 1% раствора Твина 80 (об. / Об.) С получением 10 5 спор / мл. Колбы, содержащие 500 мл среды дрожжевой экстракт-сахароза (ДА) с добавлением нулевого, 32 и 48% меда, инокулировали 2,0 мл этой суспензии, инкубировали при 28 ° C в течение 21 дня, а затем анализировали на афлатоксины [18,19].

Изучение влияния меда на прием микотоксинов мышами

Сорок два самца швейцарских мышей-альбиносов возрастом примерно 7 недель и весом 20 ± 3 г были получены из колонии приюта для животных Национального исследовательского центра, Каир, Египет.Животных содержали индивидуально в клетках из нержавеющей стали при контролируемой температуре (24–26 ° C), влажности (40–70%) и условиях освещения (12-часовой цикл свет / темнота) и позволяли свободный доступ к дистиллированной воде и основной диете (AIN- 93 М) на 10 дней в качестве адаптивного периода. Порошок AIN-93 M содержал белок (14%), крахмал (62,07%), сахарозу (10%), жир (4%), клетчатку (5%), минеральную смесь (3,5%), смесь витаминов (1%). ), L-цистин (0,18%), битратрат холина (0,25%) и тетрабутилгидрохинон (0,00008%) [20].

Затем мышей случайным образом разделили на шесть групп (по 7 животных в каждой). Группа 1 st получала диету AIN-93 M и вводила охратоксин A (10 нг / кг массы тела / день, группа ОТ). Группа 2 и группа лечились так же, как и группа 1, за исключением того, что она получала мед / диету AIN-93 M (группа HOT). Группе 3 (AT) и H (HAT) скармливали диету AIN-93 M и мед / AIN-93 M, соответственно, и вводили смесь афлатоксинов (1 мкг / кг массы тела / день). Группы 5 (NTC) и 6 (HTC) служили контролем и получали рацион AIN-93 M и медовый AIN-93 M соответственно.Эксперимент проводился в течение 2 месяцев, и животных еженедельно взвешивали для расчета суточной дозы. Животным внутрибрюшинно вводили 0,5 мл 0,05% колхицина за 2 часа до умерщвления, чтобы задержать клетки костного мозга и сперматоциты в стадии метафазы после голодания в течение ночи. Содержимое слепой кишки собирали в чистые пробирки Эппендорфа. Бедро, печень, почки, селезенка, легкие, яички и мозг были удалены.

Активность микробных ферментов толстой кишки

Активность бактериальной β-глюкуронидазы определяли в пищеварении содержимого слепой кишки с помощью P-нитрофенил-β-D-глюкуронида (Fluka, продукт No.73677) [21]. Разведение слепой кишки проводили при 4 ° C. Реакционная смесь содержала 0,3 мл раствора субстрата (5 моль P-нитрофенил-β-D-глюкуронида / л) и 0,2 мл разбавленной слепой кишки (1 часть слепой кишки и 2 части фосфатного буфера pH 6,4, мас. / Об.) И хорошо перемешивалась. , инкубировали при 37 ° C / 48 часов. Концентрацию высвободившегося п-нитрофенола измеряли от до оптического поглощения при 400 нм после добавления 2,5 мл 0,1 н. NaOH для остановки реакции. Активность фермента выражали как образовавшийся молярный продукт / г содержимого слепой кишки.

Исследование хромосомных аберраций

Хромосомы были приготовлены, окрашены 5% красителем Гимза в фосфатном буфере (pH 6,8), и 50 метафазных спредов были проанализированы на каждое животное на предмет хромосомных аберраций в клетках костного мозга [22]. Также были исследованы хромосомные аберрации в половых клетках семенников тех же животных [23].

Гистопатологическое исследование

Биопсии печени, почек, селезенки, легких и мозга фиксировали в 10% забуференном растворе формалина в течение 12 часов и превращали в парафиновые блоки.Срезы ткани толщиной 5 мм вырезали на предметных стеклах с альбумином и окрашивали гематоксилином и эозином (Hx. & E.). Для правильной оценки фиброза ткани и лучшей демонстрации кровеносных сосудов в срезах ткани также использовалось окрашивание трихромом Массона [24].

Исследования пробиотических бактерий толстой кишки

Подсчитывали эндогенные популяции пробиотических бактерий толстой кишки (лактобациллы и бифидобактерии). В конце эксперимента у каждого животного собирали образцы содержимого слепой кишки.Образцы содержимого слепой кишки немедленно (в течение 30 минут) помещали в сосуд для анаэробов и хранили при 4 ° C до анализа (максимум 6 часов). 100-кратные серийные разведения проводили в предварительно восстановленном растворе Рингера, содержащем 0,5% цистеина. Чашки Петри с различными средами инокулировали и инкубировали в течение 72 часов при 37 ° C в анаэробной атмосфере с использованием Gen Kits в сосудах Oxoid. Бактерии были обнаружены на следующих селективных средах: среда deMan, Rogosa, Шарпа (MRS) (Oxoid, Hampshire, Великобритания) для лактобацилл и среда триптон-фитоновых дрожжей (TPY) (Oxoid) для бифидобактерий.После инкубации подсчитывали колонии. Количество бактерий выражается как log 10 колониеобразующих единиц (log 10 КОЕ / г) свежего образца содержимого слепой кишки с пределом обнаружения 3,30 log 10 КОЕ / г.

Статистика

Все данные были выражены как среднее ± стандартная ошибка (SEM) среднего и проанализированы с помощью одностороннего дисперсионного анализа ANOVA с использованием статистической программы SAS (SAS версия 6.11, SAS Institute, Кэри, Северная Каролина). В случае значимости для сравнения различий между средними значениями использовали критерий множественного диапазона Дункана.Уровни значимости были проверены.

Результаты

Влияние меда на продукцию микотоксинов

Исследования in vitro показали, что биомасса A. parasiticus была увеличена в среде, содержащей 32% меда. Однако биомы A. ochraceus были уменьшены в среде, содержащей 32 и 48% меда. Охратоксин А не производился ни при одной концентрации меда. С другой стороны, производство афлатоксинов B 1 , B 2 , G 1 и G 2 увеличивалось в среде, содержащей 32% меда, но снижалось в среде с высокой концентрацией меда без образования афлатоксина B 2 и G 2 (таблица).Как правило, мы не обнаружили положительной связи между массой мицелия и производством микотоксинов.

Таблица 1

Влияние меда на массу мицелия и концентрацию микотоксинов.

FRR 106022 10,60 228
Мед% Масса мицелия (г) Концентрация микотоксинов (мкг / л)

FRR 2748

B1 B2 G1 G2 71 14,69 12,69 8,99 7,70 5,00 32,03
32,15 40,40 13,60 15,00 15,00 30,00 10,00 5,80 00,00 1,18 00,00 00,00

Влияние меда на активность глюкуронидаз толстой кишки

Влияние пробиотических β-бета-глюкуронидаз на активность эндогенных бактерий толстой кишки содержимое слепой кишки представлено в таблице.Уровень глюкуронидазы был очень низким, и достоверных различий в его содержании в слепой кишке между всеми группами не наблюдалось (P <0,05).

Таблица 2

Влияние различных обработок микотоксинами и медом на активность бактериальных глюкуронидаз в содержимом слепой кишки мышей.

9022 9022 9022 9022 9022 9022 9022 .39 ± 0,11
β-глюкуронидазы мкмоль / г Группы

OT HOT AT 0,40 ± 0,12 0,32 ± 0,10 0,37 ± 0,10 0,38 ± 0,14 0,42 ± 0,13

Генотоксические эффекты микотоксинов на клетки костного мозга

Настоящее исследование введение афлатоксинов (B 1 , B 2 , G 1 и G 2 ) и охратоксина А самцам мышей вызвало структурные и численные хромосомные аберрации (таблица и рисунок).

Таблица 3

Средние значения различных типов хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей-самцов, получавших охратоксин А и афлатоксины (B 1 , B 2 , G 1 и G 2 ).

9022 Дезинфекция 9228
Обработанные группы Числовые аберрации Структурные аберрации

Перидиплоидия
OT 2,50 ± 0,45 a 0,67 ± 0,17 a 0.67 ± 0,21 a 0,83 ± 0,17 b 2,50 ± 0,00 a 0,83 ± 0,21 a 5,50 ± 0,31 b
HOT 0,50 ± 0,00 a 0,50 ± 0,00 a 0,50 ± 0,00 b 0,83 ± 0,21 b 0,67 ± 0,17 a 3,0004
AT 2.83 ± 0,67 a 0,67 ± 0,017 a 0,67 ± 0,17 a 4,33 ± 1,31 a 1,17 ± 0,21 b 0,83 ± 0,21 0,83 ± 0,21 0,83 ± 0,21 ± 0,48 a
HAT 2,50 ± 0,36 a 0,50 ± 0,00 a 0,50 ± 0,00 a 0,67 ± 0,17 b 1.00228 0.50 ± 0,00 a 3,17 ± 0,21 c
NTC 2,00 ± 0,22 a 0,50 ± 0,00 a 0,50 ± 0,00 0,50

27

0,50 ± 0,00

24

24

27 б

0,83 ± 0,21 б 0,50 ± 0,00 а 2,83 ± 0,21 в
HTC 2,00 ± 0,34 а 0,508 0,50 .50 ± 0,00 a 0,50 ± 0,00 b 0,67 ± 0,17 b 0,50 ± 0,00 a 2,67 ± 0,17 c

мужских спредов охратоксин А и афлатоксины, показывающие: а) ослабление центромеры. б) удаление. В) разрыв хроматиды (маленькая стрелка), фрагмент (большая стрелка) клеток костного мозга и г) полиплоидия. д) аутосомно-однолистный. F) x-y одновалентных клеток сперматоцитов.

Структурные хромосомные аберрации регистрировались в виде хроматидных разрывов, хроматидных разрывов (рисунок), центромерных аттенуаций (рисунок), делеций (рисунок) и фрагментов (рисунок). В таблице представлены средние значения различных структурных хромосомных аберраций, индуцированных микотоксинами в клетках костного мозга мышей-самцов. Результаты показывают низкую частоту хроматидных промежутков, разрывов и фрагментов, тогда как частота центромерного ослабления была значительно высокой между группой AT и группой HAT с одной стороны и между группой AT и контрольными группами (NTC и HTC) с другой стороны.

Значительная разница (P <0,05) была также обнаружена в делециях (рисунок) между группой OT и группой HOT, а также между группой OT и контрольными группами (NTC и HTC), что можно отнести к защитному эффекту меда.

Значительное увеличение (P <0,05) частоты общих структурных хромосомных аберраций было обнаружено между группой OT и группой HOT с одной стороны и между группой OT и контрольными группами (NTC и HTC) с другой стороны. Также была обнаружена значительная разница между группой AT по сравнению с группой HAT и контрольными группами (NTC и HTC), соответственно.

Генотоксическое действие микотоксинов на половые клетки (сперматоциты)

Результаты нашего исследования показали, что пероральное лечение охратоксином А и афлатоксинами (B 1 , B 2 , G 1 и G 2 ) индуцировало численные и структурные хромосомные аберрации в половых клетках мышей-самцов (таблица). Численные аберрации регистрировались как перидиплоидия (n ± 1 или n ± 2) и полиплоидия (рисунок). Перидиплоидия, наблюдаемая в сперматоцитах мышей-самцов, четко различалась (p ≤ 0.5) только в группе, получавшей афлатоксины (AT), по сравнению с контрольными группами (NTC и HTC). Однако полиплоидия, индуцированная группой, обработанной охратоксином А (OT), значительно отличалась (P <0,05) по сравнению с контрольными группами. Между тем, общие числовые аберрации значительно различались (P <0,05) как в группе, получавшей охратоксин А (группа ОТ), так и в группе, получавшей афлатоксины (AT), по сравнению с контрольными группами (NTC и HTC). Защитный эффект меда проявился только в группе HAT.

Таблица 4

Средние значения различных типов хромосомных аберраций в клетках сперматоцитов мышей-самцов, получавших охратоксин А и афлатоксины (B 1 , B 2 , G 1 и G 2 ).

9rax 9034 Обработка с помощью A 9034 высокоиндуцированные структурные хромосомные аберрации, особенно униваленты xy (рисунок), где значительная разница (P <0.05) была обнаружена между группами OT и HOT, а также между группами OT и контрольными группами (HTC).

Влияние меда на пролиферацию клеток

При микроскопическом исследовании контрольной ткани печени были обнаружены гексагональные печеночные дольки, состоящие из центральной вены, из которой были видны печеночные канатики, синусоиды, выстланные излучающими клетками Купфера, а также желчные каналы. Портальный тракт располагался между тремя долями печени и состоял из воротной вены, печеночной артерии и желчного протока (рисунок).

Печень группы НТК. Нормальная ткань печени (H x. И E. × 100).

Введение охратоксина А повлияло на ткань печени, так как оно вызвало расширенные и застойные центральные вены с выраженным синусоидальным расширением, застоем и гиперпластическими купферовыми клетками (рисунок). Также был очевиден очаговый некроз печени, преимущественно периваскулярный (рисунок). Введение меда с охратоксином А не выявило положительного эффекта, так как печень в группе АОТ была поражена так же, как и в группе ОТ. С другой стороны, введение афлатоксинов вызвало мутный отек в гепатоцитах, обширные вариабельные боковые некротические области, поражающие паренхиму печени и инфильтрованные нейтрофилами и макрофагами (рисунок).Также были очевидны перегруженность расширенных центральных вен и выраженная синусоидальная дилатация с гиперплазией хупферовских клеток (рисунок). Портальные тракты утолщены мононуклеарными воспалительными клетками, образованными в основном лимфоцитами и телеангиэктатическими, перегруженными сосудистыми каналами (рисунок).

Печень ОТ группы. Расширенные, застойные центральные вены отмечали расширение и гиперемию синус-дуги (Hx. И E. × 200).

Печень ОТ группы. Очаговый некроз печени преимущественно перисосудистый (Hx.И E. × 200).

Печень группы АТ. Некротические участки паренхимы печени, инфильтрованные нейтрофилами (Hx. & E. × 100).

Печень группы АТ. Застойные расширенные центральные вены и выраженная синусоидальная дилатация (Hx. И E. × 400).

Печень группы АТ. Портальные тракты утолщены за счет заметной дилатации и закупорки сосудистых каналов и умеренного воспалительного инфильтрата мано-ядерной области (Hx. И E. × 400).

Гистопатологическое исследование контрольных тканей почек показало клубочки, проксимальные и дистальные извитые почечные канальцы, в мозговом веществе находились собирательные канальцы и части восходящей и нисходящей петли курицы.Введение охратоксина А вызывало мутное набухание проксимальных извитых канальцев, фибриновый тромбин в петлях клубочковых капилляров, увеличение количества и размера клубочков (рисунок), а также интерстициальный фиброз и скопление (рисунок). С другой стороны, совместное введение меда с охратоксином А улучшило действие охратоксина А на почки, где сосудистая полость нормализовалась. Однако они все же были немного увеличены (рисунок). Введение афлатоксинов вызывало мутный отек эпителиальной выстилки почечных канальцев с легким интерстициальным фиброзом и застоем (рисунок).

Почка ОТ группы. Увеличение количества и размера клубочков (Hx. И E. × 100).

Почка ОТ группы. Интерстициальный фиброз и гиперемия (трихром Massons × 100).

Почка группы HOT. Вернитесь к норме, за исключением заложенности сосудов (Hx. И E. × 200).

Почка группы АТ. Мутное набухание эпителия канальцев (Hx. & E. × 100).

Что касается воздействия охратоксина на мозг, гистологическое исследование показало наличие очагов дегенерации (рисунок), тогда как совместное введение меда с охратоксином А улучшило этот эффект.Кроме того, введение афлатоксина не вызывало каких-либо изменений в мозговой ткани.

Мозг. Очаги дегенерации в группе ОТ (Hx. & E. × 100).

Гистопатологическое исследование контрольного легкого показало тонкие альвеолярные стенки, состоящие из эпителиальных клеток с обеих сторон центрально расположенных капилляров без промежуточной стромы соединительной ткани. Введение охратоксина А повлияло на ткани легкого, где в легком наблюдались отек, застой, лимфоидные агрегаты в интерстициальной ткани (рисунок).Результаты показали, что легкое облегчило застойные явления (одновременный прием меда с охратоксином А) (рисунок). Принимая во внимание, что легкие показали интерстициальный фиброз и воспалительный инфильтрат после введения афлатоксина (рисунок).

Легкое группы ОТ. Отек, гиперемия, лимфоидные скопления интерстициальной ткани (Hx. И E. × 100).

Легкое группы HOT. Облегчение отека, но отек и лимфоцитарные агрегаты все еще присутствуют (Hx. И E. × 100).

Легкое группы АТ.Показан интерстициальный фиброз, воспалительное заполнение очаговыми лимфоцитарными агрегатами (трихром Massons × 100).

Контрольная ткань селезенки показала каркас соединительной ткани (который включает капсулу, трабекулы и ретикулярную соединительную ткань) и паренхиму лимфоидной ткани в виде белой (лимфоидные узелки) и красной пульпы (рисунок). На рисунке проиллюстрировано влияние охратоксина А на селезенку, где показано расширение белой пульпы с разрушением нормальной архитектуры, адвентициальное утолщение артериол, адвентициальное утолщение артериол, очаговый фиброз красной пульпы и сжатие синусоидов.

Селезенка группы NTC. Вызваны аналогичные гистопатологические, бело-красные пульпы. (Hx. И E. × 100).

Селезенка группы ОТ. Расширение белой пульпы с облитерацией нормальной архитектуры (Hx. & E. × 100).

С другой стороны, введение афлатоксинов не показало никаких изменений в ткани селезенки. Совместное введение меда с афлатоксинами вызывает улучшение всех гистопатологических изменений, которые произошли во всех исследованных органах, кроме ткани почек.

Влияние меда на пробиотические бактерии толстой кишки

Добавление меда к порошковой диете AIN-93 M (группа HTC) увеличивало количество бифидобактерий в среднем на 2,3 ± 0,23 log 10 КОЕ / г (p <0,004) и lactobacilli в среднем на 1,07 ± 0,35 log 10 КОЕ / г (p <0,016) по сравнению с группой NTC (таблица).

Таблица 5

Влияние меда и микотоксинов на рост LAB (log 10 КОЕ / г).

Обработанные группы Численные аберраций Структурные аберрации

Peridiploidy полиплоидия Итого XY унивалентов аутосомно унивалентов Итого
OT 1,75 ± 0,48 ab 3,75 ± 0,48 a 5,25 ± 0,48 a 2.75 ± 0,48 а 1,00 ± 0,41 а 3,75 ± 0,86 а
ГОРЯЧИЙ 1,50 ± 0,29 abc 2,75 ± 0,25

8

2,75 ± 0,25

8

1,00 ± 0,41 b 0,75 ± 0,25 a 1,75 ± 0,63 a
AT 2,25 ± 0,25 a 1,2550 ± 0,29 b 2,00 ± 0,92 ab 0,75 ± 0,75 a 2,75 ± 0,95 a
HAT 1,50 ± 0,29

228c

2,00 ± 0,0,41 1,50 ± 0,29 ab 0,50 ± 0,29 a 2,00 ± 0,58 a
NTC 0,75 ± 0,48 9000 0,75 ± 0,48 9000 .41 b 1,50 ± 0,29 c 1,50 ± 0,29 ab 1,00 ± 0,41 a 2,50 ± 0,29 a
a
9 0228 0,25 ± 0,25 b 1,00 ± 0,41 c 1,00 ± 0,14 b 1,00 ± 0,00 a 2,00 ± 0,00 a
Штаммы Группы мышей

OT HOT AT HAT 9028 3.26 ± 0,19 3,83 ± 0,20 Нет Нет 5,00 ± 0,15 6,06 ± 0,22
Бифидобактерии
3,73 ± 0,19 9022 9022 3,73 ± 0,19 9022 3,77 ± 0,22 6,26 ± 0,29 8,57 ± 0,24

Введение охратоксина А в группу, получавшую мед (группа HOT), увеличило количество лактобактерий в среднем на 0,75 ± 0.15 log 10 КОЕ / г (p <0,108) по сравнению с группой ОТ. Лактобациллы не обнаруживались при введении афлатоксинов (группы HAT и AT) (таблица).

Введение смеси охратоксина А и афлатоксинов в присутствии меда (группы HOT и HAT) увеличило среднее количество бифидобактерий на 1,03 ± 0,32 log 10 КОЕ / г (p <0,083) и 0,57 ± 0,50 log 10 КОЕ / г (p <0,219) по сравнению с группами ОТ и АТ соответственно.

Обсуждение

Влияние меда на продукцию микотоксинов

Наши результаты показывают, что влияние меда на биомассу и образование микотоксинов ( in vitro, ) зависело от вида грибов ( A.parasiticus и A. ochraceus ) и концентрации меда. Об антимикробных свойствах перекиси водорода и неперекисных компонентов меда сообщалось в нескольких исследованиях [25]. Таким образом, для этих 2 типов грибов мед нейтрализовал больше патогенов дозозависимым образом, чем контрольный сахарный раствор (80%), состоящий из фруктозы и глюкозы, аналогично чистому меду [25]. Неразбавленный мед полностью подавлял рост обычных грибов поверхностной инфекции и заражения ран ( Aspergillus fumicgatus, A flavus, Penicellum citrinum, Trichophyton rubrum и Candida albicans ), частичное подавление с концентрацией меда 50% и отсутствие подавления было зарегистрировано концентрация меда 20% [26].

Влияние меда на пробиотические бактерии толстой кишки

Лактобациллы и бифидобактерии имеют сложные пищевые потребности, такие как углеводы, аминокислоты, пептиды, сложные эфиры жирных кислот, соли, производные нуклеиновых кислот и витамины, которые сильно различаются от вида к виду. Мед содержит более 180 веществ, в том числе аминокислоты, витамины, минералы и ферменты [5]. Основными углеводными составляющими меда являются фруктоза (32,56%) и глюкоза (28,54%). Помимо олигосахаридов (1.От 58 до 3,77% мальтозы, 0,78 ± 2,03% туранозы, 1,11 ± 2,81% нигерозы, 0,05 ± 0,15% мели-биозы, 0,03 ± 0,08% панозы, 0,24 ± 1,03% мальтотриозы, 0,21 ± 0,37% мелецитозы и 0,10 ± 0,25%. Мед также содержит от 4 до 5% фруктоолигосахаридов, которые служат пробиотическими агентами [4].

Нормальная слизистая оболочка тонкой кишки человека может не полностью поглощать фруктозу. Несколько исследований показали, что распространенность мальабсорбции фруктозы у здоровых взрослых может достигать 30–50%, эти субъекты могут нарушать всасывание заметного количества 25 г фруктозы [27].Наиболее нормальные субъекты мальабсорбируют около 10% углеводов, содержащихся в меде [28]. Олигосахариды меда с низкой степенью полимеризации считаются благоприятным субстратом для бифидобактерий [10]. Наконец, неперевариваемые и / или неабсорбируемые сахариды перемещаются в толстую кишку, чтобы вызвать селективную ферментацию и селективную стимуляцию роста и активности пробиотических бактерий в толстой кишке, как было обнаружено ранее [29].

Настоящее исследование подтверждает имитирующий эффект меда на пробиотические бактерии толстой кишки.Рост кишечных Bifidobacteria spp. был усилен наличием более чем лактобацилл, что может быть связано с олигосахаридами меда с низкой степенью полимеризации (от 4 до 5%).

Уменьшение количества пробиотических бактерий толстой кишки при введении микотоксина и в отсутствие или в присутствии меда может быть связано с изменениями бактериальной поверхности во время фазы роста в результате связывания микотоксинов [13].

Влияние меда на активность бактериальных ферментов толстой кишки

Уровень глюкуронидаз является важным показателем влияния диеты на состав и активность кишечной микрофлоры.Он участвует в образовании, а также в инактивации канцерогенов в просвете кишечника и может быть положительно изменен присутствием пробиотических бактерий толстой кишки [30].

Антигенотоксические эффекты меда

Было обнаружено, что микотоксины генотоксичны для костного мозга и клеток сперматоцитов мышей, что совпадает с предыдущими сообщениями [31,32] о том, что охратоксин А и афлатоксины вызывали хромосомные аберрации во многих клетках млекопитающих (мыши , крыса, китайский хомяк и даже человек).

Используя смесь охратоксина А и афлатоксинов в качестве токсичных и канцерогенных веществ, мы охарактеризовали потенциальную антигенотоксичность меда. Мед был антигенотоксичным ( in vivo ), и этот эффект зависел от пробиотических бактерий толстой кишки и других факторов. Предполагается, что пробиотические бактерии толстой кишки обладают несколькими полезными эффектами, включая инактивацию канцерогенов [15]. Помимо открытия, что пробиотические бактерии толстой кишки обладают антигенотоксическими свойствами, непосредственный интерес представляет изучение механизмов, ответственных за их защиту.Было высказано предположение, что белковая структура липополисахаридной мембраны бактерий может быть эффективным компонентом [33]. Кроме того, было несколько сообщений о том, что молочнокислые бактерии (LAB) могут связывать мутагены и, таким образом, могут снижать мутагенность [34].

Пищевые факторы, содержащиеся в меде, можно использовать для предотвращения и устранения мутации, вызванной афлатоксинами [35]. Это соответствовало нашим выводам, которые показали, что можно предотвратить или уменьшить хромосомные аберрации, вызванные афлатоксинами.Кроме того, вызванное AFB1 повреждение ДНК и хромосомные аберрации в клетках грызунов и человека могут регулироваться множеством факторов, включая питательные вещества и химиопрофилактические агенты [36]. Это согласуется с нашими результатами, согласно которым прием меда может улучшить генетический материал и минимизировать хромосомные аберрации, вызванные микотоксинами.

Влияние меда на пролиферацию клеток

Настоящие результаты гистопатологического исследования показали, что охратоксин А вызывает кровотечение и некроз красной пульпы селезенки.Этот вывод соответствует работе [30]. Кроме того, некроз белой пульпы затронул корковые и мозговые области лимфоидных фолликулов. Кроме того, охратоксин А связан с нарушением структуры и функции клеточной мембраны мозга [31]. Он может заметно увеличивать активность цитозольных и лизосомальных ферментов.

В настоящем исследовании влияние афлатоксинов на печень согласуется с ранее проведенной работой [32], которая объяснила это влияние увеличением цитоплазматической легкости и потерей цитоплазматической зернистости гепатоцитов.Также были зарегистрированы периоптальный фиброз с дегенерацией и изъязвлением желчных дуэтов, выстилающих эпителиальные клетки, и пролиферация желчных протоков [33]. Были очевидны мультифокальные, случайно распределенные области некроза печени, инфильтрованные нейтрофилами и макрофагами. Поражения были центральными, более выраженными вокруг портала и аналогичным результатом [34]. Результаты настоящей работы согласуются с ранее опубликованными [35] о том, что у крыс, получавших внутрибрюшинную инъекцию афлатоксина B 1 , наблюдалась выраженная воспалительная реакция в легких, застой, разрушение альвеолярных стенок с амфизематозными изменениями и утолщение стенки кровеносных сосудов, возникающие в пятнистых участках легочной ткани.

На основании гистопатологического исследования можно сделать вывод, что добавление меда к охратоксину А лишь немного улучшило микроскопические изменения почечной ткани. Однако добавление афлатоксинов к меду улучшило гистопатологические изменения, вызванные токсином, в различных органах, за исключением ткани почек.

Наши результаты показали, что вредное воздействие микотоксинов может быть уменьшено в присутствии меда, что может быть связано с детоксикацией микотоксинов пробиотическими бактериями.В то же время доступность связанного AFB1 с антителом предполагает, что поверхностные компоненты этих бактерий участвовали в связывании токсина [13]. Изменение температуры (от 4 до 37 ° C) и pH (от 2 до 10) не оказало значительного влияния на количество высвобождаемого AFB1. Связывание AFB1, по-видимому, является преимущественно внеклеточным для жизнеспособных и подвергнутых термической обработке бактерий. Однако обработка кислотой может разрешить внутриклеточное связывание. Во всех случаях связывание обратимо, но стабильность образующихся комплексов зависит от штамма, обработки и условий окружающей среды.Как правило, отделение AFB1 от бактериальной поверхности требует времени. В течение этого времени AFB1 выполняет запись вдоль желудочно-кишечного тракта в направлении изгнания. Эта секвестрация AFB1 снижает возможность его реабсорбции или оказания патогенного воздействия на энтероциты или лимфоидную ткань, ассоциированную с кишечником (GALT). Это может быть чистым эффектом детоксикации микотоксинов из организма. Кроме того, наши результаты совместимы с [36], так как охратоксин A демонстрирует мутное набухание проксимальных извитых канальцев в дополнение к канальцевым эозиногильным внутрипросветным цилиндрам, фибриновым тромбам в петлях клубочковых капилляров и выраженному интерстициальному фиброзу и застою.

Афлатоксины являются генотоксическими канцерогенами. Для этого типа канцерогенов обычно считается, что не существует пороговой дозы, ниже которой не могло бы произойти образование опухоли. Другими словами, только нулевой уровень воздействия не приведет к отсутствию риска. Это согласуется с недавней оценкой [37] в отношении генотоксичности афлатоксина [38]. Необходимо провести углубленные исследования, чтобы выяснить влияние фазы роста всех штаммов пробиотических бактерий на связывание AFB 1 и G 1 и других микотоксинов in vitro и in vivo .

Заключение

Настоящие результаты показывают, что мед обладает защитным действием, зависящим от его антимикробных свойств. Также мед усиливает эндогенные пробиотические бактерии толстой кишки (бифидогенные эффекты), что оказывает несколько полезных эффектов (например, детоксикация и антигенотоксичность).

Мы рекомендуем заменять сахар медом в высокой концентрации в обработанных пищевых продуктах, детских смесях, детских закусках, особенно в тех, которые изготовлены из сельскохозяйственных материалов (например,грамм. молотый горох и кукуруза), чтобы избежать роста грибов и образования микотоксинов. Согласно результатам, полученным в этой статье, доза смеси афлатоксинов, превышающая 1 мкг афлатоксинов на кг веса тела в день, оказывает выраженное вредное воздействие. Это подтверждается недавно проведенным Европейским союзом обсуждением ограничения максимально допустимого содержания афлатоксинов в пищевых продуктах.

Список сокращений

Группа ОТ — группа 1, порошковая диета AIN-93 M, получавшая и вводившая охратоксин А (10 нг / кг массы тела / день).

HOT группа -группа 2, мед, порошковая диета AIN-93 M, получавшая и вводившая охратоксин А (10 нг / кг массы тела / день).

AT группа — группа 3, порошковая диета AIN-93 M, получавшая и вводимая смесью афлатоксинов (1 мкг / кг массы тела / день).

HAT группа — группа 4, мед, порошок AIN-93 M, диета, полученная и вводимая смесью афлатоксинов (1 мкг / кг массы тела / день).

НТК группа -группа 5, АИН-93 М порошковое диетическое скармливание.

HTC group -группа 6, мед АИН-93 М порошковый диетический скармливаемый.

Конкурирующие интересы

Автор (ы) заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Вклад авторов

Али Эзз Эль-Араб задумал и спроектировал исследование и выполнил микробные ферменты толстой кишки (он также позаботился об экспериментальном животном в сотрудничестве с Шенудой Гиргисом, который исследовал хромосомные аберрации). Эман Хегази провел гистологическое исследование, а Аззат Абд эль-Халек подсчитал пробиотические бактерии. Все авторы сообщили данные и написали эту рукопись.

Благодарности

Первый автор выражает благодарность доктору Хани С. Эль-Незами, Департамент биохимии и химии пищевых продуктов, Университет Турку, 20014, Турку, Финляндия, за его лекцию о пробиотических бактериях и AFB1 в Национальном исследовании Центр, Докки, Гиза, Египет.

Ссылки

  • Саарела М., Латенмаки Л., Криттенден Р., Салминен С., Маттила-Сандхольм Т. Кишечные бактерии и здоровая пища — европейская перспектива. Intern J Food Microbiol.2000. 278: 99–117. [PubMed] [Google Scholar]
  • Verschuren PM. Функциональные продукты питания: научные и глобальные перспективы. Br J Nutr. 2002; 88: S125 – S130. DOI: 10,1079 / BJN2002675. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Bazzarre TL, Wu, SML Yuhas JA. Общие концентрации и ЛПВП после приема йогурта и кальция. Nutr Reports Intern. 1983; 28: 1225–1232. [Google Scholar]
  • Чоу Дж. Пробиотики и пребиотики: краткий обзор. J Ren Nutr. 2002; 12: 76–86. [PubMed] [Google Scholar]
  • White JW.Состав меда. В: Crane E, редактор. Мед: всеобъемлющий обзор. Лондон, Хайнеманн; 1979. С. 157–192. [Google Scholar]
  • Аль-Мамарья М., Аль-Мериб А., Аль-Хабориб М. Антиоксидантные свойства и общие фенольные соединения различных видов меда. Nutr Res. 2002; 22: 1041–1047. DOI: 10.1016 / S0271-5317 (02) 00406-2. [CrossRef] [Google Scholar]
  • Беннетт Дж. В., Клих М. Микотоксины. Обзор Clin Microb. 2003. 16: 497–516. DOI: 10.1128 / CMR.16.3.497-516.2003. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Генри Ш., Bosch FX, Troxell TC, Bolger PM.Уменьшение рака печени — глобальный контроль афлатоксина. Наука. 1999; 286: 2453–2454. DOI: 10.1126 / science.286.5449.2453. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Койпер-Гудман Т. Безопасность пищевых продуктов: микотоксины и фикотоксины в перспективе. В: Miraglia M, Van Edmond H, Brera C, Gilbert J, редактор. Микотоксины и фикотоксины — разработки в области химии, токсикологии и безопасности пищевых продуктов. Alaken Inc., Форт-Коллинз, Колорадо; 1998. С. 25–48. [Google Scholar]
  • Кадзивара С., Ганди Х., Устунол З. Влияние меда на рост и выработку кислоты кишечными бактериями Bifidobacterium spp.: in vitro Сравнение с коммерческими олигосахаридами и инулином. J food prod. 2002; 65: 214–218. [PubMed] [Google Scholar]
  • Salminen S, Bouley MC, Boutron-Rualt MC, Cummings J, Frank A, Gibson E, Isolauri E, Moreau MC, Roberfroid M, Rowland I. Наука о функциональном питании, физиология и функции желудочно-кишечного тракта. Br J Nutr. 1998; 1: 147–171. DOI: 10,1079 / BJN19980108. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Эль-Незами Х., Микнен Х., Канкаанп П., Салминен С., Ахокас Дж.Способность штаммов Lactobacillus и propionibacterium удалять афлатоксин B1 из двенадцатиперстной кишки цыпленка. J Food Prot. 2000; 63: 549–552. [PubMed] [Google Scholar]
  • Haskard CA, El-Nezami HS, Kankaanp PE, Salminen S, Aholmas JT. Поверхностное связывание афлатоксина B1 молочнокислыми бактериями. Appl Environ Microbiol. 2001; 67: 3086–3091. DOI: 10.1128 / AEM.67.7.3086-3091.2001. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Gratz S, Mykkänen H, Ouwehand AC, Juvonen R, Salminen S, El-Nezami H.Кишечная слизь изменяет способность пробиотических бактерий связывать афлатоксин B1 In Vitro . Appl Environ Microbiol. 2004. 70: 6306–6308. DOI: 10.1128 / AEM.70.10.6306-6308.2004. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Pool-Zobel BL, Neidecker C, Domizlaff I, Ji S, Schillinger U, Rumney C, Moretti I, Vilarini I, Scassellati-Sforzolini R, Rowland I. • Антигенотоксичность, опосредованная лактобактериями и бифидобактериями, в толстой кишке крыс. Nutr Cancer. 1996. 26: 365–380. [PubMed] [Google Scholar]
  • A.OAC «Официальные методы официальных химиков-аналитиков. Арлингтон, Вирджиния, США. 2000.
  • Park D, Neslein S, Trucksess MW, Starck ME, Newel RF. Метод жидкостной хроматографии для определения афлатоксинов B-1, B2, G1 и G2 в продукты из кукурузы и арахиса. J Assoc Off Anal Chem. 1990; 73: 260–266. [PubMed] [Google Scholar]
  • Haspolat K, Buyukbas S, Cengel H. In vitro антибактериальный и противогрибковый эффект меда. Turk Hijyen — Ve — Денейсел-Бийолоджи-Дергиси.1990; 47: 211–216.[Google Scholar]
  • Wahdan HA. Противомикробный эффект меда. Египетская J Lab Med. 1996; 8: 29–44. [Google Scholar]
  • Ривз П., Нильсен Ф., Фэи Г. Очищенные диеты AIN-93 для лабораторных грызунов: заключительный отчет специального комитета по написанию Американского института питания о разработке рациона для грызунов AIN-76A. J Nutr. 1993; 123: 1939–1951. [PubMed] [Google Scholar]
  • Djouzi Z, Andrieux C. Сравнивали эффекты трех олигосахаридов на метаболизм кишечной микрофлоры у крыс, привитых фекальной флорой человека.Br J Nutr. 1997; 78: 313–324. DOI: 10,1079 / BJN19970149. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Preston RJ, Dean BJ, Galloway S, Holden H, McFee AF, Shelby M. Mammalian in vivo цитогенетический анализ . Mutat Res. 1987. 189: 157–165. DOI: 10.1016 / 0165-1218 (87) -8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Руссо А. In vivo цитогенетика: половые клетки млекопитающих. Mutat Res. 2000; 455: 167–189. [PubMed] [Google Scholar]
  • A.F.I.P. Институт патологии Вооруженных Сил.Лабораторные методы в гистотехнологии. Вашингтон; 1994. [Google Scholar]
  • Wahdan HAL. Причины антимикробной активности меда. Заразить. 1998; 26: 26–30. [PubMed] [Google Scholar]
  • Efem SEE, Udoh KT, Lwara CI. Антимикробный спектр меда и его клиническое значение. Заразить. 1992. 20: 277–285. [Google Scholar]
  • Мишкин Д., Саблаускас Л., Яловский М., Мишкин С. Нарушение всасывания фруктозы и сорбита у амбулаторных пациентов с функциональной диспепсией: сравнение с нарушением переваривания / нарушением всасывания лактозы.Dig Dis Sci. 1997. 42: 2591–2596. DOI: 10.1023 / А: 1018841402133. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Ladas SD, Raptis SA. Мед, абсорбция фруктозы и слабительный эффект. J Nutr. 1999; 15: 591–592. DOI: 10.1016 / S0899-9007 (99) 00092-1. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Цимер С.Дж., Гибсон Г.Р. Обзор пробиотиков, пребиотиков и синбиотиков в концепции функционального питания: перспективы и будущие стратегии. Int Dairy Journal. 1998. 8: 473–479. DOI: 10.1016 / S0958-6946 (98) 00071-5.[CrossRef] [Google Scholar]
  • Налини Н., Манджу В., Менон В.П. Влияние кокосового жмыха на активность бактериального фермента при раке толстой кишки, вызванном 1,2-диметилгидразином. Clin Chim Acta. 2004; 342: 203–210. DOI: 10.1016 / j.cccn.2004.01.001. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Groose Y, Chekir-Ghedira L, Huc A, Obrecht-Pflumio S, Dirheimer G, Bacha H, Pfohl-Leszkowicz A. Сетчатка, аскорбиновая кислота и альфа-токоферол предотвращают образование аддуктов ДНК у мышей, получавших микотоксины охратоксин А и зеараленон.Раковый латыш. 1997. 114: 255–229. DOI: 10.1016 / S0304-3835 (97) 04676-4. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Wang JS, Groopman JD. Повреждение ДНК микотоксинами. Mutat Res. 1999; 424: 167–81. [PubMed] [Google Scholar]
  • Zhang XB, Ohta Y. Антимутагенность клеточных фракций микроорганизмов в отношении сильнодействующих мутагенных пиролизатов. Mutat Res. 1993; 298: 247–253. DOI: 10.1016 / 0165-1218 (93)

    -V. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Эль-Незами Х., Канкаанпаа П., Салминан С., Ахокас Дж. Способность молочных штаммов молочнокислых бактерий связывать общий пищевой канцероген, афлатоксин B1.Food Chem Toxicol. 1998. 36: 321–326. DOI: 10.1016 / S0278-6915 (97) 00160-9. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Шарманов Т.Ш., Ников П.С., Алдабергенова К.У., Меербекова Б.Т. Влияние типа питания и афлатоксина B1 на структуру хромосом. Вопр Питан. 1986; 5: 56–60. [PubMed] [Google Scholar]
  • Munro IC, Scott PM, Moodie CA, Willes RF. охратоксин Возникновение и токсичность. J Am Vet Med Assoc. 1973; 63: 1269–1273. [PubMed] [Google Scholar]
  • Monnet-Tschudi F, Sorg O, Honegger P, Zurich M, Hugget AC, Schilter B.Влияние встречающегося в природе пищевого микотоксина хроматоксина А на клетки мозга в культуре. Нейротоксикология. 1997; 18: 831–840. [PubMed] [Google Scholar]
  • Кларк Д., Джаир А.В., Хэтч Р. Влияние различных видов лечения на индуцированный хронический афлатоксикоз у кроликов. Am J Vet Res. 1982; 43: 106–110. [PubMed] [Google Scholar]
  • Эль-Захан Х., Эль-Ашри М.А., Тарват Е.Е., Саад М.М., Амин С.О. Кролик и афлатоксины: влияние смеси афлатоксинов на кровь, компоненты плазмы природы Новой Зеландии, штамбы белого кролика.Египетский кролик J Sci. 1996; 6: 55–56. [Google Scholar]
  • Уэно Ю. Токсикология микотоксинов. CRC Crit Rev Toxicol. 1985. 14: 99–132. [PubMed] [Google Scholar]
  • Gopuiath C, Prentic DE, Lewis DJ. Атлас экспериментальной токсикологической патологии. Current, гистопатология, MTP press limited, lan coraster, Boston The Hague-Derdecht. 1987. 30: 43–61. [Google Scholar]
  • Albassam MA, Yong SI, Bhatnagar R, Sharma AK, Prior MG. Гистопатологические и электронно-микроскопические исследования острой токсичности охратоксина А у крыс.Vet Pathol. 1987. 24: 427–435. [PubMed] [Google Scholar]

Мед манука — это основной продукт лечебной кладовой, который улучшит большинство аспектов вашей жизни

Мед существует всегда, но он возродился в наше время, имеет как «суперпродукт», так и лекарство с тонны пользы для здоровья.

Как и большинство продуктов, мед бывает разным по качеству и, следовательно, целебным свойствам. Медвежий медведь, с которым вы выросли, подойдет в крайнем случае, хотя были некоторые вопросы относительно качества и добавленных ингредиентов для многих коммерческих брендов.Но мед манука является золотым стандартом, когда речь идет о изрядной дозе исцеления и пользы для здоровья.

Мед манука, произрастающий в Новой Зеландии, обладает антибактериальными, противовирусными, противовоспалительными и антиоксидантными свойствами, которые отличают его от традиционного меда. На самом деле, по данным Healthline, он традиционно использовался для заживления ран, снятия боли в горле, предотвращения кариеса и улучшения пищеварения.


ЧТЕНИЕ ПО ТЕМЕ: Все, что вам нужно знать о льняном семени — и о том, что оно может для вас сделать


Производится пчелами, опыляющими цветы куста манука ( Leptospermum scoparium ), благодаря чему мед обладает улучшенными антибактериальными свойствами. Не идентифицировали и не изучали до 1980-х годов.И хотя вы, возможно, думаете обо всем, что слышали о сыром меде, мед манука еще лучше. Дополнительные соединения — метилглиоксаль (MGO), дигидроксиацетон (DHA) и некоторые другие — делают его еще более полезным как для внутреннего, так и для местного применения, сообщает MindBodyGreen.

Говоря о местном применении, мед манука — это основной продукт кладовой, как кокосовое масло и яблочный уксус, который творит чудеса с кожей. Некоторым людям нравится смешивать смесь ингредиентов, таких как овес и куркума, с медом манука для создания маски для лица своими руками.Другие ругаются, умывая им лицо.

Почему? Ну, потому что было показано, что мед манука увеличивает выработку коллагена (который, в свою очередь, увеличивает эластичность кожи), уменьшая темные пятна и действуя как противовоспалительное средство, помогающее лечить такие кожные заболевания, как розацеа и прыщи. Не говоря уже о том, что он удерживает влагу, — объясняет MindBodyGreen.

Помимо украшения, мед манука способствует спокойному глубокому сну, медленно высвобождая гликоген, необходимый для основных функций организма во время сна.Добавление меда в молоко перед сном помогает организму высвобождать мелатонин в мозг, который необходим для глубокого сна, считает доктор Акс.

В 2007 году мед манука был одобрен FDA как средство для лечения ран, благодаря его известным антибактериальным и антиоксидантным свойствам. Многочисленные исследования показали, что вязкая жидкость может усилить регенерацию тканей и уменьшить боль у пациентов, страдающих ожогами. Кроме того, мед манука эффективен при лечении раневых инфекций, вызванных устойчивыми к антибиотикам штаммами, такими как Staphylococcus aureus (MRSA), сообщает Healthline.

Возможно, в западном мире мед чаще всего используется для снятия боли в горле — в конце концов, он содержится в большинстве леденцов от кашля — и мед манука не исключение. Мало того, что его антибактериальные, противовирусные и противогрибковые свойства создают идеальный трифект для лечения, но его густая текстура покрывает и успокаивает горло, помогая уничтожить вредные бактерии на своем пути. Мед манука может помочь предотвратить кашель и не дать вам уснуть по ночам. Одна столовая ложка прямо в рот — это все, что вам нужно, сообщает MindBodyGreen.

Наконец, мед манука славится своими преимуществами для здоровья кишечника, особенно SIBO (избыточный бактериальный рост в тонком кишечнике), низким содержанием кислоты в желудке и кислотным рефлюксом или ГЭРБ. Эксперты говорят, что он может уравновесить вредные бактерии в кишечнике, которые могут лечить и успокаивать пищеварение, помогать предотвращать инфекции и укреплять иммунитет. Он также эффективен в уничтожении бактерий, вызывающих язву желудка (Helicobacter pylori).

Прежде чем отправиться в Whole Foods, чтобы запастись медом манука, вам следует знать несколько вещей.Во-первых, он обычно продается с рейтингом, цифрами или символами, указывающими на антибактериальную силу активного меда. Например, вы можете увидеть на этикетках «NPA» (непероксидная активность), «UMF» (уникальный фактор мануки) или «MGO / MG» (метилглиоксаль). Короче говоря, чем выше число, тем выше антимикробная активность, сообщает Refinery29.

Если вы хотите использовать мед манука в качестве пищи или тонизирующего средства, тогда нет необходимости покупать «более активный» тип, но он может понадобиться, если он используется для заживления ран, например порезов или царапин.Тогда вам понадобится что-то стерильное и с высоким уровнем антимикробной активности, объясняет Refinery29.

Кроме того, весь мед манука (по определению) является сырым и непастеризованным, чтобы сохранить в нем полезные живые ферменты и другие соединения. Если вы покупаете мед манука с любым из вышеперечисленных рейтингов, вы можете быть уверены, что он сырой и непастеризованный, отмечает MindBodyGreen.

Преимущества сырого меда: полезны для кишечника и многое другое!

Я считаю, что всегда лучше получать питательные вещества из пищи, которую мы едим, а не из добавок.

Естественно, когда я недавно услышал, что мед, в особенности сырой (или натуральный) мед, приносит пользу для здоровья, начиная от усиления иммунной системы до защиты сердечно-сосудистой системы, я был заинтригован.

Я немедленно начал исследовать всевозможную информацию, касающуюся меда и его преимуществ. То, что я обнаружил, убедило меня в том, что, возможно, сырой мед должен быть в моей аптечке, а не только на кухне!

Несколько месяцев назад я поделился с вами тем, насколько важно защитить вашу пищеварительную систему, если вы принимаете антибиотики.Один из способов сделать это — убедиться, что вы едите достаточно продуктов с «хорошими бактериями», также известными как пробиотики, ваш кишечник должен быть здоровым.

Помимо поддержки нашей пищеварительной системы, пробиотики также помогают при запорах, резкости ума, диарее, тревоге и депрессии, а также укрепляют нашу иммунную систему, помимо других преимуществ. Все это проблемы, которые особенно волнуют бумеров, а не молодых людей.

Особенность пробиотиков в том, что они довольно разборчивы в том, что им нужно есть, чтобы оставаться здоровыми, пока они делают свою работу по поддержанию нашего здоровья.И им нужны пребиотики, которые поступают в виде клетчатки.

Пребиотические продукты не перевариваются человеческими ферментами, но попадают в толстый кишечник в неизменном виде. Они являются источником полезных бактерий, таких как бифидобактерии и лактобациллы.

Однако, хотя все пребиотики являются клетчаткой, не вся клетчатка считается пребиотиками. Чтобы продукт считался пребиотиком, он должен соответствовать нескольким критериям.

К ним относятся устойчивость к кислотности желудочного сока, способность ферментации пробиотиками в кишечнике и стимуляция роста и / или активности кишечных бактерий, связанных со здоровьем и благополучием.

Вот где появляется сырой мед. Как оказалось, сырой мед — отличный пребиотик! Он содержит соединения, называемые олигосахаридами, которые не усваиваются тонким кишечником. Они достигают толстой кишки, где полезные бактерии используют их для производства питательных веществ, которые мы можем использовать.

Еще одна особенность сырого меда заключается в том, что это немолочный пробиотический продукт. Это огромное преимущество, если у вас непереносимость лактозы или аллергия на молочные продукты. Поскольку молочные продукты обычно обладают пробиотическими / пребиотическими свойствами, сырой мед является отличным альтернативным источником пребиотиков.

Тем не менее, сырой мед, похоже, в первую очередь увеличивает рост только определенных видов бактерий, а именно бифидобактерий и лактобацилл. Поэтому вы можете дополнить его другими источниками клетчатки и растительной пищи, которые, как известно, являются хорошими пребиотиками, такими как бананы, лук, чеснок, камедь акации, артишоки и цельные зерна.

Как бумеры, мы прекрасно понимаем важность хорошего здоровья сердечно-сосудистой системы и всегда ищем то, что мы можем и должны делать, чтобы поддерживать здоровье нашей сердечно-сосудистой системы.Сырой мед содержит мощные антиоксиданты, такие как фенольные соединения, которые, как сообщается, снижают кровяное давление и риск сердечных заболеваний.

Некоторые исследования также показали, что употребление натурального (сырого) меда может снизить общий уровень холестерина, что также может способствовать здоровью сердечно-сосудистой системы. Чтобы получить максимальную пользу от меда, обязательно продолжайте употреблять в пищу другие полезные для сердца продукты, такие как цельнозерновые, свежие фрукты и овощи.

Мед также обладает антимикробными свойствами, которые делают его отличной мазью для лечения ран и распространенных кожных проблем, таких как ожоги, дерматит и экзема.Исследования также показали, что мед может ускорить заживление ран.

Это неудивительно, поскольку, согласно Национальному институту здоровья (NIH), «лечебные свойства меда обусловлены тем фактом, что он обладает антибактериальной активностью, поддерживает влажное состояние раны, а его высокая вязкость помогает обеспечить защитные свойства. барьер для предотвращения инфекции ».

NIH также сообщает, что мед оказывает подавляющее действие примерно на 60 видов бактерий.

Хотите верьте, хотите нет, но недавние исследования показывают, что сырой мед также может помочь в регулировании веса, поскольку он может повышать уровень гормонов, регулирующих аппетит.Есть также свидетельства того, что замена сахара сырым медом может помочь предотвратить увеличение веса и даже снизить уровень сахара в крови.

Сырой мед может быть отличной альтернативой подсластителю для диабетиков. Просто убедитесь, что употребляете его в умеренных количествах, и поговорите со своим врачом о том, как включить сырой мед в свой рацион.

Хотя исследования не позволяют сделать окончательных выводов обо всех различных преимуществах сырого меда, некоторые исследования показывают, что он может задерживать развитие некоторых видов рака. Согласно NIH, сырой мед вызывает апоптоз (гибель клеток) в различных типах раковых клеток, а его противоопухолевый эффект можно объяснить его антиоксидантными свойствами.

Безусловно, необходимы дополнительные исследования, но ученые считают, что мед потенциально подавляет развитие рака, блокируя три основных стадии канцерогенеза: начало, распространение и прогрессирование.

Если вы подумываете о добавлении меда в схемы профилактики или лечения рака, поговорите со своим врачом или онкологом, чтобы узнать, может ли это быть полезно для вас.

Когда вы собираетесь купить мед, обязательно ищите сырой или натуральный сорт.Большая часть меда, который вы найдете на полках супермаркетов, обрабатывается и нагревается, что значительно снижает содержание питательных веществ.

Сырой мед более густой и содержит пчелиную пыльцу (антиоксидант). Вы также обычно можете найти сырой мед в определенных магазинах натуральных продуктов и на местных фермах, специализирующихся на сыром меде. Найдите ближайшего к вам местного продавца сырого меда на сайте Национального совета по меду.

Используете ли вы обычно мед как часть своего режима здоровья, или вы используете его в основном для приготовления пищи и приготовления пищи? Вы обычно покупаете сырой или натуральный мед или более обработанные сорта с полок магазинов? Вы знали о пользе меда для здоровья или видели в нем в основном подсластитель или сироп? Присоединяйтесь к беседе ниже.

Влияние меда манука на энтеробактерии

Мед манука (Leptospermum scoparium), производимый в Новой Зеландии, показал значительную антибактериальную активность против широкого спектра патогенов, вызывающих инфекцию ран, и с прекрасными результатами используется при лечении ран. Эта активность обусловлена ​​как перекисью водорода, так и непероксидными компонентами. Однако мед манука может быть бесполезным для лечения бактериального гастроэнтерита, потому что желудочно-кишечная среда может быть неблагоприятной для антибактериального действия, а также потому, что невозможно достичь достаточно высокой концентрации для эффективности.Исследование в этой диссертации направлено на оценку in vitro эффективности меда манука как антибактериального средства против энтеробактерий, принимая во внимание некоторые факторы, которые могут быть задействованы в среде желудочно-кишечного тракта. Поскольку некоторые желудочно-кишечные бактерии (Campylobacter spp., Helicobacter pylori, Lactobacillus spp. И Bifidobacterium animalis subsp. Lactis) не являются аэрофильными, в этом исследовании была предпринята попытка использовать дешевую, но приемлемую систему генерации газа, альтернативную коммерческой газовой установке.Различные альтернативы сравнивались по их производительности. Метод сжигания спирта был выбран для культивирования микроаэробов и некоторых анаэробов из-за его сопоставимых характеристик с коммерческими системами с точки зрения роста видов бактерий, а также из-за простоты использования и низкой стоимости. В первой части этой диссертации была исследована чувствительность желудочно-кишечных бактерий к меду манука путем определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) и минимальной бактерицидной концентрации (МБК) с использованием стандартизированного меда манука.На протяжении всего исследования использовался мед манука со средним уровнем неперекисной антибактериальной активности (эквивалентной 16,5% фенола), за исключением Campylobacter spp. были проанализированы с более сильнодействующим медом манука, эквивалентным 29,4% фенола. Измеренная чувствительность бактерий показала, что мед манука значительно более эффективен, чем искусственный мед (смесь сахаров, как в меде), что указывает на то, что осмолярность — не единственный фактор, ответственный за антибактериальную активность меда.Было обнаружено, что некоторые виды бактерий, например Campylobacter spp. исключительно чувствительны к меду манука (и МИК, и МБК представляют собой примерно 1% раствор меда), в то время как большинство других желудочно-кишечных патогенов имеют значения МПК и МБК в диапазоне 5-10% меда, за исключением Enterobacter и Pseudomonas, которые находились в диапазоне 10-17. %. Бифидобактерии, лактобациллы и энтерококки, по-видимому, более устойчивы к меду (МИК: 9,36-14,29%; МБК: больше или равно 13,3%), чем большинство других видов. Также была изучена разница в эффективности между медом с удаленной перекисью водорода и без нее, и было обнаружено, что как перекись водорода, так и неперекисные компоненты способствуют бактериостатической и бактерицидной активности меда.Поскольку кислород необходим для производства перекиси водорода в меде, роль кислорода в антибактериальной активности меда манука была исследована путем анализа данных о чувствительности, полученных как в аэробных, так и в анаэробных условиях с использованием факультативных анаэробов. Мед манука оказался более сильным бактериостатическим средством против большинства видов бактерий в отсутствие кислорода, тогда как для уничтожения некоторых бактерий в анаэробных условиях требовалась относительно более высокая концентрация раствора меда манука.Частично это может быть связано с тем, что атмосфера также повлияла на метаболизм и, следовательно, рост бактерий. Следовательно, активность меда манука не обязательно будет снижаться в атмосфере окружающей среды кишечника. Чтобы выяснить, сколько времени требуется меду манука, чтобы убить бактерии, были проведены исследования времени, необходимого для уничтожения бактерий, путем мониторинга выживаемости бактерий в меде манука. Установлено, что требуется 20% раствор меда манука со средней активностью более 6 часов, чтобы убить 90% клеток большинства исследованных видов, если бактериальные клетки находятся в контакте с медом.Это говорит о том, что мед манука не обладает быстрым бактерицидным действием, и что вряд ли удастся полностью искоренить бактериальную кишечную инфекцию путем приема небольшого количества меда манука в течение короткого периода времени. Было обнаружено, что пробиотики могут выжить в 20% растворе меда более 12 часов. Фармакодинамика антибактериальной активности меда манука была изучена для изучения выживаемости и повторного роста бактерий после обработки медом. Было обнаружено, что после кратковременного воздействия меда манука (1 час) рост большинства энтеропатогенов замедляется примерно на 2-4 часа, прежде чем он вернется к полной скорости.Анализы этого постантибиотического эффекта также показали, что латентность повторного роста после воздействия меда не пропорциональна профилям MIC, MBC или времени до уничтожения. Наконец, эффективность меда манука на бактерии была изучена в условиях, имитирующих среду в желудке и кишечнике. Тестируемые бактерии не могли расти в кислых условиях, как в желудке, поэтому невозможно было определить, обладал ли мед какой-либо антибактериальной активностью в этих условиях.В условиях, имитирующих кишечную среду, результаты показали, что антибактериальная активность меда манука несколько снижается в умеренно щелочных условиях кишечника (pH 7,5). Было обнаружено, что в присутствии панкреатина и желчи при одинаковом pH активность меда манука снижается более чем на 50%. Это говорит о том, что панкреатин и желчь в кишечнике могут отрицательно влиять на эффективность антибактериальной активности меда манука in vivo. Это указывает на то, что, хотя проглоченный мед манука все еще может оказывать некоторое антибактериальное действие в кишечнике, антибактериальная активность будет отличаться от той, которая обычно исследуется с помощью исследований чувствительности in vitro.Гастроэнтерит обычно лечится раствором для пероральной регидратации (ПРС), который состоит из углеводов и электролитов. Мед манука можно использовать вместо обычного углеводного компонента ПРС, и он обеспечит дополнительную биоактивность, такую ​​как антибактериальная активность и стимуляция роста пробиотиков, что сделает раствор для регидратации меда более полезным для пациентов с гастроэнтеритом, чем традиционный ПРС. После некоторого первоначального исследования для определения наиболее подходящей дозировки и частоты приема может потребоваться клиническое испытание.

Воздействие антибиотиков нарушает микробиоту кишечника и увеличивает смертность пчел

Abstract

Микробиомы кишечника играют решающую роль в здоровье животных, и изменения в структуре микробного сообщества кишечника могут иметь пагубные последствия для хозяев. Исследования на моделях позвоночных животных и людей предполагают, что лечение антибиотиками сильно нарушает естественное кишечное сообщество, тем самым способствуя распространению патогенов. Фактически, стойкие инфекции после лечения антибиотиками являются серьезной медицинской проблемой.В пчеловодстве антибиотики часто используются для предотвращения бактериальных инфекций личинок пчел, но влияние вызванного антибиотиками дисбактериоза (микробного дисбаланса) на здоровье пчел и их восприимчивость к болезням до конца не выяснено. Здесь мы оценили влияние воздействия антибиотиков на размер и состав кишечных сообществ медоносных пчел. Мы отслеживали выживаемость пчел после лечения антибиотиками, чтобы определить, влияет ли дисбактериоз кишечного микробиома на здоровье пчел, и провели эксперименты, чтобы определить, увеличивает ли воздействие антибиотиков восприимчивость к инфекции условно-патогенными микроорганизмами.Наши результаты показывают, что лечение антибиотиками может оказывать стойкое влияние как на размер, так и на состав микробиома кишечника медоносной пчелы. Воздействие антибиотиков привело к снижению выживаемости как в улье, так и в лабораторных экспериментах, в которых пчелы подвергались воздействию условно-патогенных бактериальных патогенов. В совокупности эти результаты предполагают, что дисбактериоз, возникающий в результате воздействия антибиотиков, влияет на здоровье пчел, отчасти из-за повышенной восприимчивости к повсеместно распространенным условно-патогенным микроорганизмам. Наши результаты не только подчеркивают важность микробиома кишечника для здоровья пчел, но и дают представление о том, как лечение антибиотиками влияет на микробные сообщества и здоровье хозяина.

Сведения об авторе

Появляется все больше доказательств важности кишечных микробов для здоровья животных. В отличие от большинства других насекомых, пчелы обладают высококонсервативным микробным сообществом кишечника, которое приобретается в результате социальных контактов, и некоторые результаты свидетельствуют о том, что эти микробы играют важную роль в здоровье пчел. Антибиотики, которые могут серьезно нарушить микробные сообщества кишечника, широко используются в пчеловодстве в нескольких странах. Однако неизвестно, как лечение антибиотиками влияет на микробные сообщества кишечника медоносных пчел.Здесь мы оценили влияние лечения антибиотиками на размер и состав микробиома кишечника медоносной пчелы и на здоровье пчелы. Мы обнаружили, что воздействие антибиотиков значительно изменяет структуру микробного сообщества кишечника пчел и приводит к снижению выживаемости пчел в улье, вероятно, из-за повышенной восприимчивости к инфекции условно-патогенными микроорганизмами.

Образец цитирования: Raymann K, Shaffer Z, Moran NA (2017) Воздействие антибиотиков нарушает микробиоту кишечника и повышает смертность медоносных пчел.PLoS Biol 15 (3): e2001861. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2001861

Академический редактор: Джефф Гор, Массачусетский технологический институт, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 20 декабря 2016 г .; Принято к печати: 8 февраля 2017 г .; Опубликовано: 14 марта 2017 г.

Авторские права: © 2017 Raymann et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все считывания гена 16S рРНК доступны в биопроекте чтения последовательности NCBI (PRJNA338694), а все другие соответствующие данные находятся в документе и его вспомогательных информационных файлах.

Финансирование: Премия Национального научного фонда США «Измерения биоразнообразия» (номер гранта 1415604). Получено NAM. Спонсор не имел никакого отношения к дизайну исследования, сбору и анализу данных, принятию решения о публикации или подготовке рукописи. Премия Национального института здравоохранения (номер гранта 1R01GM108477-01).Получено NAM. Спонсор не имел никакого отношения к дизайну исследования, сбору и анализу данных, принятию решения о публикации или подготовке рукописи. Премия Национального института продовольствия и сельского хозяйства (номер гранта 2017-67012-26088). Получено КР. Спонсор не имел никакого отношения к дизайну исследования, сбору и анализу данных, принятию решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Сокращения: AFB, Американский гнилец; ПЗС, расстройство распада колонии; ОТУ, оперативная таксономическая единица; tetL , г. ген устойчивости к тетрациклину

Введение

Сообщества кишечных микробов влияют на здоровье животных разными способами, включая синтез витаминов, переваривание пищи, защиту от патогенов и модуляцию поведения, развития и иммунитета [1].Сообщество кишечных микробов может быть нарушено несколькими факторами: одним из наиболее серьезных источников беспокойства для людей и домашних животных является лечение антибиотиками, которое может серьезно изменить размер и состав сообщества [2]. Лечение антибиотиками также было связано с появлением устойчивых патогенов, таких как Clostridium difficile и Salmonella enterica [3–5]. Многочисленные исследования показали, что сокращение микробного разнообразия кишечника происходит в течение нескольких дней после приема антибиотиков [1,6,7], а полное восстановление первоначального состава бактериального сообщества достигается редко [7].Фактически, было высказано предположение, что чрезмерное использование антибиотиков навсегда изменило наш микробиом, вызвав рост «современных бедствий», таких как ожирение, астма, диабет и некоторые формы рака [8]. Однако продолжительность и степень вызванного антибиотиками нарушения микробиоты кишечника остаются плохо изученными, особенно на уровне видов и штаммов, где разнообразие кишечного сообщества является наибольшим [9,10]. Характеризовать изменения в размере и составе микробиоты у млекопитающих-хозяев особенно сложно из-за сложности их кишечных сообществ.

Модельные организмы предоставляют возможности для изучения взаимодействия хозяина и микробиома с уровнем экспериментального контроля, который недостижим в исследованиях на людях, и модели могут использоваться для понимания общности ассоциаций между микробиомом и заболеванием. Кишечные сообщества социальных насекомых, таких как пчелы ( Apis mellifera ), особенно полезны в качестве моделей, поскольку они имеют общие черты с кишечными сообществами млекопитающих. Как и у млекопитающих, пчелы приобретают кишечную микробиоту через социальные контакты [11], в отличие от многих беспозвоночных, которые приобретают кишечные бактерии из источников окружающей среды.Подобно людям, микробиота кишечника медоносных пчел состоит из специфических для хозяина видов бактерий, которые живут только в кишечнике хозяина [12] и демонстрируют значительное разнообразие штаммов в пределах отдельных хозяев [13]. Однако, в отличие от человека и других млекопитающих, пчелы имеют относительно простую микробиоту кишечника, в которой преобладают только восемь основных видов бактерий, которые составляют 95–99% бактерий в кишечнике [14,15]. Таким образом, пчела представляет собой управляемую систему для изучения функции и эволюции микробных сообществ, связанных с хозяином.Кроме того, пчелы имеют глобальное значение в качестве сельскохозяйственных опылителей [16]. С 2006 г. в мировых семьях пчел наблюдался повышенный уровень смертности, что связано с множеством факторов [17,18]. Некоторые результаты показывают, что микробиом кишечника способствует здоровью пчел [19–22]. Следовательно, дисбактериоз (микробный дисбаланс) может повлиять на здоровье пчел и их восприимчивость к болезням.

Еще одна параллель между микробиомами медоносных пчел и людей — долгая история воздействия антибиотиков, мощного источника беспокойства для кишечных сообществ.Обработка пчелиных семей антибиотиками уже более 50 лет широко используется в США для предотвращения бактериального заболевания личинок пчел, называемого гнильцем ( Paenibacillus larvae ) [23–25]. Два антибиотика, наиболее часто используемые пчеловодами, — это тетрациклин (или родственное ему соединение окситетрациклин) и, с 2006 года, тилозин. Тетрациклины также используются для лечения бактериальных инфекций у людей и обычно включаются в корм для скота, что приводит к приобретению устойчивости к тетрациклину у многих бактерий, включая некоторые патогенные таксоны [26].Аналогичным образом, использование тетрациклина в пчеловодстве США привело к накоплению генов устойчивости в микробиомах медоносных пчел США по сравнению с шмелями или пчелами в странах, которые не используют антибиотики в пчеловодстве [27]. О широко распространенной устойчивости к антибиотикам сообщалось в P . larvae , бактериальный патоген, вызывающий американский гнилец (AFB) [28], и ген устойчивости ( tetL ), обнаруженный в P . Личинки идентичны по последовательности одному из локусов устойчивости у симбионтов кишечника медоносных пчел [27], что предполагает горизонтальный перенос в прошлом между комменсальными кишечными бактериями и этим патогеном.

В этом исследовании мы оцениваем влияние воздействия тетрациклина на выживаемость пчел, а также на размер и состав кишечных сообществ медоносных пчел. Мы взяли образцы обработанных пчел в разные моменты времени после контакта, чтобы определить, восстанавливается ли микробиом до состояния, предшествующего обработке. Мы отслеживали выживаемость после лечения в ульях, чтобы определить, влияет ли дисбиоз кишечника на здоровье пчел, и проверили, увеличивает ли воздействие антибиотиков восприимчивость к инфекции условно-патогенными микроорганизмами, присутствующими в ульях.Наши результаты показывают, что лечение тетрациклином серьезно изменяет как размер, так и состав микробиома кишечника медоносной пчелы. Более того, нарушения, вызванные лечением тетрациклином, все еще были очевидны через неделю после того, как пчелы вернулись в свои ульи после воздействия. Наши результаты показывают, что дисбиоз, вызванный тетрациклином, может снизить выживаемость пчел, и предполагают, что это отражает повышенную восприимчивость к условно-патогенным микроорганизмам.

Результаты

Взрослые рабочие пчелы были собраны из расплода одного улья.Пчел кормили стерилизованным фильтром сахарозным сиропом (контрольные) или тетрациклином, суспендированным в стерилизованном фильтром сахарозном сиропе (обработки) в течение 5 дней, прежде чем их возвращали в улей или содержали в лаборатории в стерильных условиях (т. Е. Содержали только с другими пчелами, обработанными тетрациклином. от их когорты) или открытых (т. е. с нормальными рабочими, собранными из их улья) условий восстановления. Чтобы определить, как лечение антибиотиками влияет на продолжительность жизни, размер и состав микробиома кишечника, пчелы были обследованы и взяты образцы в нескольких временных точках после обработки.Микробиоту кишечника оценивали на общее количество бактерий и состав сообщества с помощью количественной ПЦР и глубокого секвенирования ампликона области бактериального гена 16S рРНК.

Лечение антибиотиками привело к значительным изменениям в размере сообщества, начиная с первого дня отбора проб (день 0, перед повторным введением в улей) (рис. 1A и 1B). Ни один из основных видов не был полностью уничтожен обработкой тетрациклином, но общая численность бактерий, а также абсолютная численность нескольких видов снизились у обработанных пчел (тест Вилкоксона, p <0.05) (рис. 1B и 1C). Из восьми основных видов бактерий, обнаруженных в кишечнике медоносной пчелы [14], лечение тетрациклином значительно повлияло на четыре. Больше всего пострадали грамположительные таксоны: Bifidobacterium , Lactobacillus Firm-5 и Lactobacillus Firm-4 (тест Вилкоксона, p <0,0001) (рис. 1C). У грамотрицательных видов, Snodgrassella alvi , также наблюдалось снижение в день 0 (критерий Вилкоксона, p <0,05) (рис. 1C). Хотя изменения в абсолютной численности были замечены в момент первого отбора проб, никаких значительных изменений в относительной численности местных бактериальных таксонов обнаружено не было (S1 Рис.).

Рис. 1. Изменения микробиоты кишечника медоносной пчелы после 5 дней лечения тетрациклином (день 0 после лечения).

A) График с накоплением в столбцах, показывающий численность видов бактерий в кишечнике пчел у контрольных пчел ( n = 14) и лечебных пчел ( n = 15). Численность видов бактерий пчелиного кишечника оценивалась с поправкой на абсолютную численность (оцененная с помощью кПЦР) и с учетом количества оперонов рРНК на геном (таблица S1). B) Коробчатая диаграмма общих копий бактериального гена 16S рРНК, оцененных с помощью количественной ПЦР для контрольных и лечебных пчел. C) Коробчатые диаграммы, показывающие снижение численности четырех видов сердцевины кишечника у экспериментальных пчел (оценено путем умножения процентной относительной численности каждого вида на общее количество копий бактериального гена 16S рРНК и поправки на количество оперонов рРНК на геном). Графики в виде прямоугольников и усов показывают высокие, низкие и медианные значения, причем нижний и верхний края каждого прямоугольника обозначают первый и третий квартили, соответственно. * = p <0,05 и *** = p <0,0001, критерии суммы рангов Вилкоксона.См. Данные S1 для получения информации об абсолютной и относительной численности.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2001861.g001

После возвращения в улей пчелы были учтены, чтобы определить влияние обработки тетрациклином на продолжительность жизни. Восстановление обработанных пчел (32%) из улья на 3-й день после обработки было значительно ниже, чем восстановление контрольных пчел (64%) (критерий хи-квадрат, p <0,0001) (рис. 2A). Повторный эксперимент по выживанию, проведенный в другом улье, также показал, что пчелы, получавшие тетрациклин, имеют повышенную смертность в улье (S2A, рис.).Мы также провели лабораторные эксперименты по восстановлению, чтобы контролировать возраст, определить влияние тетрациклина на выживаемость стерильных пчел и определить, может ли микробиом пчелиного кишечника восстановиться при воздействии на рабочих из их улья или без такого воздействия. Дополнительные эксперименты, проведенные на пчелах, содержащихся в лаборатории, показали, что снижение выживаемости не связано с побочными эффектами тетрациклина (S2B – S2D, рис.). Для пчел, обладающих их естественной микробиотой, лечение антибиотиками вызывало снижение выживаемости во время выздоровления у пчел, содержащихся в лаборатории, как для стерильных пчел-выздоравливающих, так и для пчел, подвергшихся воздействию необработанных рабочих ульев (критерий хи-квадрат, p <0.0001) (S2B и S2C Рис.). Напротив, для стерильных пчел лечение антибиотиками не привело к увеличению смертности по сравнению с контрольной группой (S2D, рис.).

Рис. 2. Изменения выживаемости и кишечного сообщества пчел, вернувшихся в улей после лечения тетрациклином.

A) Число рабочих, выведенных из улья на 3-й день после обработки ( p <0,0001, критерий хи-квадрат). Аналогичные результаты были получены во втором эксперименте с другим ульем (S2A, фиг.).См. Данные S2 для подсчета выживаемости. BD) Состав микробиома кишечника пчелы после обработки Дни 0 (контроль n = 13, обработка n = 15), 3 (контроль n = 14, обработка n = 12), 5 (контроль n = 15, обработка n = 15) и 7 (контроль n = 15, обработка n = 14) B) Столбчатый график с накоплением, показывающий абсолютное количество видов бактерий, присутствующих в контроле и обработке пчелы. C) Коробчатая диаграмма общих копий бактериального гена 16S рРНК для контрольных и экспериментальных пчел после обработки в дни 0, 3, 5 и 7. Графики прямоугольной формы показывают высокие, низкие и средние значения с нижним и верхним края каждого квадрата, обозначающие соответственно первый и третий квартили. *** = p <0,0001, критерии суммы рангов Вилкоксона. D) Столбчатый график с накоплением, показывающий относительную численность видов бактерий у контрольных и экспериментальных пчел в дни 0, 3, 5 и 7. Данные об абсолютной и относительной численности см. В разделе «Данные S1».

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2001861.g002

У пчел брали пробы на 3, 5 и 7 дни для оценки долгосрочного воздействия антибиотиков на состав кишечного сообщества. Пчелы, обработанные тетрациклином и вернувшиеся в улей, показали изменения как в составе сообщества, так и в размере во всех точках отбора проб после обработки (тест Вилкоксона, p <0,05) (рис. 2B – 2D). Контрольные пчелы имели в среднем в пять раз больше бактериальных клеток в кишечнике, чем пчелы, получавшие тетрациклин, и это несоответствие было очевидным во всех временных точках после обработки (рис. 2В и 2С).Четыре основных таксона, абсолютная численность которых снизилась в день 0 (критерий Вилкоксона, p <0,001) (т. Е. Bifidobacterium , Firm-4, Firm-5 и S . alvi ), продолжали оставаться значительными. уменьшилось во всех временных точках (S3A – S3D Рис.). Другой основной вид, Bartonella apis , который не претерпел значительных изменений в день 0, был уменьшен во всех последующих временных точках отбора проб (критерий Вилкоксона, p <0,001) (S3E, фиг.). Кроме того, абсолютная численность нескольких других видов изменилась в разные моменты времени после того, как пчел вернули в улей (тест Вилкоксона, , p <0.05). Два основных вида (Alpha 2.1 и Frischella perrara ) и один вид из окружающей среды ( Lactobacillus kunkeei ) были уменьшены в одной или нескольких временных точках (S4A – S4C, рис.). Напротив, несколько неосновных таксонов, включая род Serratia и неклассифицированные бактерии семейства Halomonadaceae , показали повышенную численность на 3-й и 5-й дни соответственно (тест Вилкоксона, p <0,05) (S4D и S4E Рис. ). Дополнительные эксперименты, в которых пчелы содержались в лаборатории после обработки тетрациклином, продемонстрировали аналогичные эффекты на размер и состав сообщества (S5, рис.), Но не показали увеличения числа неосновных бактерий.

В дополнение к увеличению числа неосновных бактериальных таксонов у пчел, получавших тетрациклин, мы также наблюдали явное увеличение грибковых последовательностей у обработанных пчел на 3–7 дни на основании диагностических ПЦР-анализов (S6A, рис.). Однако все идентифицированные таксоны грибов (см. Материалы и методы) были тесно связаны с таксонами дрожжей, выделенными из цветов (рис. S6B), что позволяет предположить, что они являются временными в кишечнике этих пчел и, вероятно, более многочисленны и обнаруживаются у обработанных пчел, поскольку меньше бактерий присутствуют.У некоторых обработанных пчел типично специфические грибковые праймеры амплифицировали растительную ДНК (S6B фиг.), Что позволяет предположить, что матрица грибковой ДНК редко встречается в образцах.

После того, как пчел вернули в улей, различия в составе сообщества также стали очевидны в относительной численности отдельных видов (Рис. 2D, S7 и S8, Рис.). Среднее относительное количество видов бактерий оставалось стабильным у контрольных пчел на протяжении всех периодов отбора проб, тогда как у экспериментальных пчел наблюдалось значительное изменение микробного состава кишечника, которое не было стабильным с течением времени и не возвращалось к исходному составу через одну неделю (S7 Рис).Что касается основных бактерий кишечника, относительная численность Bifidobacterium , Firm-4, Firm-5 и B . apis были уменьшены на 3, 5 и 7 дни (S7 и S8, фиг.). Однако относительная численность Gilliamella apicola была намного выше у обработанных пчел (S7 и S8, рис.).

Исходя из относительной численности, лечение антибиотиками также вызывало изменения в разнообразии микробиоты у отдельных хозяев (альфа-разнообразие) и в дивергенции микробиоты между отдельными хозяевами (бета-разнообразие) (тест Вилкоксона, p <0.05) (рис.3). Альфа-разнообразие, измеренное как индекс H Шеннона, было ниже у экспериментальных пчел во все моменты времени, кроме дня 0 (критерий Вилкоксона, p <0,0001) (рис. 3A). Бета-разнообразие, измеренное как среднее различие Брея-Кертиса, было ниже среди контрольных пчел, чем между контрольными и экспериментальными пчелами во все моменты времени (тест Вилкоксона p <0,0001) (рис. 3B). Анализ основных координат (невзвешенный и взвешенный UniFrac, [29]) показал, что состав кишечного сообщества лечебных пчел широко рассредоточен, в отличие от плотной кластеризации, наблюдаемой у контрольных пчел (рис. 3C и 3D).Кроме того, для пчел, содержащихся в лабораторных клетках, состав кишечных сообществ экспериментальных пчел по сравнению с контрольными пчелами демонстрировал аналогичные модели кластеризации на основе невзвешенного и взвешенного UniFrac: обработанные пчелы имели более рассредоточенные сообщества как для стерильных пчел, так и для пчел, подвергшихся воздействию других пчел в социальных группах ( S9A – S9D Рис.).

Рис. 3. Альфа и бета разнообразие экспериментальных и контрольных пчел.

A) Разница в альфа-разнообразии между контрольными и экспериментальными пчелами в каждый момент времени (измеряется как H Шеннона). B) Среднее несходство Брея-Кертиса в кишечных сообществах контрольных пчел по сравнению с контрольными пчелами и пчелами-обработчиками. Графики в виде прямоугольников и усов показывают высокие, низкие и медианные значения, причем нижний и верхний края каждого прямоугольника обозначают первый и третий квартили, соответственно. * = p <0,05 и *** = p <0,0001, критерии суммы рангов Вилкоксона. C) Анализ главных координат с использованием невзвешенного UniFrac. D) Анализ главных координат с использованием взвешенного UniFrac.См. Данные S3 для информации об альфа- и бета-разнообразии.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2001861.g003

Чтобы оценить влияние обработки тетрациклином на мелкомасштабные штаммы и видовое разнообразие, мы подсчитали количество 99% операционных таксономических единиц (ОТЕ), присвоенных каждый род. В день 0 после лечения не было обнаружено значительных различий в 99% разнообразии OTU, но на 3, 5 и 7 дни общее количество OTU было значительно ниже у экспериментальных пчел (критерий Вилкоксона, p <0.05) (Рис. 4A). В частности, Bifidobacterium , Фирма-4, Фирма-5 и B . apis показал уменьшение мелкомасштабного разнообразия (критерий Вилкоксона, p <0,05) (рис. 4B – 4E). Это согласуется с уменьшением относительной и абсолютной численности этих видов (Рис. 1 и S3 Рис.). Кроме того, увеличение относительной численности G . apicola также соответствует увеличению разнообразия OTU на 99% на 3 и 7 дни после лечения (тест Вилкоксона, p <0.001) (рис. 4F).

Рис. 4. Изменения мелкомасштабного бактериального разнообразия у пчел, получавших тетрациклин, на основе 99% OTU, обнаруженных на 0, 3, 5 и 7 дни после обработки.

A) Общее количество 99% бактериальных ОТЕ, присутствующих у контрольных и лечебных пчел BE) Количество 99% ОТЕ для четырех видов ( Bifidobacterium , Firm-5, Firm-4 и B . apis ) которые показали значительное уменьшение разнообразия на 3, 5 и 7 дни после лечения. F) Количество ОТЕ для рода Gilliamella , которые показали значительное увеличение разнообразия ОТЕ на 3-й и 7-й дни у экспериментальных пчел.Графики в виде прямоугольников и усов показывают высокие, низкие и медианные значения, причем нижний и верхний края каждого прямоугольника обозначают первый и третий квартили, соответственно. * = p <0,05, ** = p <0,001 и *** = p <0,0001, критерии суммы рангов Вилкоксона. См. Данные S4 для 99% данных OTU.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2001861.g004

Чтобы выяснить, влияют ли условно-патогенные микроорганизмы на повышенную смертность обработанных пчел, возвращающихся в улей, мы провели эксперименты по заражению с использованием штамма Serratia . выделенный из кишок медоносной пчелы ( Serratia kz11).В одном эксперименте мы подвергли контролируемых по возрасту пчел (появившихся в лаборатории в тот же день) к Serratia kz11 после обработки тетрациклином (см. Материалы и методы). В другом эксперименте мы выставляли неконтролируемые по возрасту пчелы, взятые из расплода в улье. В обоих экспериментах пчелы подвергались воздействию Serratia kz11 через пищу в течение 2 дней. (Жизнеспособные клетки Serratia можно получить из перги в срок до 2 дней после инокуляции). Как в экспериментах с контролируемым, так и неконтролируемым возрастом пчелы, обработанные тетрациклином и подвергшиеся воздействию Serratia kz11, демонстрировали повышенную смертность по сравнению с контрольными пчелами, пчелами, подвергавшимися только тетрациклину, или пчелами, подвергавшимися только воздействию Serratia (рис. , Данные S5 и данные S6).

Рис. 5. Выживаемость пчел, подвергшихся воздействию Serratia после обработки тетрациклином.

A) Число контрольных пчел и пчел, получавших тетрациклин (с контролем возраста), живых после воздействия Serratia kz11. Для каждой группы было выполнено пять повторов. Контрольным пчелам давали стерильный сахарный сироп в течение 5 дней, а опытным пчелам вводили 450 мкг / мл тетрациклина в стерильном сахарном сиропе в течение 5 дней с последующим воздействием i) Serratia kz11 или ii) только стерильного сахарного сиропа.Выживаемость контролировалась и регистрировалась каждый день в течение 10 дней (данные S7). B) Процент выживаемости пчел с контролируемым возрастом после воздействия Serratia , представленный в виде кривой выживаемости Каплана-Мейера, созданной с использованием GraphPad Prism. Статистический анализ проводился с использованием модели coxph, реализованной в пакете «выживаемость» [30] в R (S5 Data). C) Число контрольных пчел и пчел, получавших тетрациклин (без контроля возраста), живых после воздействия Serratia kz11. Для каждой группы было выполнено пять повторов.Выживаемость контролировалась и регистрировалась каждый день в течение 10 дней (данные S8). D ) Кривая выживаемости Каплана-Мейера, показывающая процент выживаемости пчел без контроля возраста после воздействия Serratia . Кривая выживаемости была создана с использованием GraphPad Prism. Статистический анализ проводился с использованием модели coxph, реализованной в пакете «выживаемость» [30] в R (S6 Data).

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2001861.g005

Чтобы подтвердить, что Serratia kz11 может быть условно-патогенным микроорганизмом медоносных пчел, мы провели эксперимент с бактериальным заражением, в котором мы подвергали пчел воздействию различных бактерий после приема тетрациклина. лечение.Мы подвергали контрольных и лечебных пчел i) Serratia kz11, ii) Escherichia coli K-12, iii) S . alvi wkB2, iv) Lactobacillus sp. wkB8. Последние два вида являются частью микробиома кишечника пчелы [12], а E . coli K-12 — лабораторный непатогенный штамм [31]. Только пчелы, подвергшиеся воздействию Serratia kz11, показали увеличение смертности у контрольных и обработанных пчел по сравнению с контрольными пчелами (рис. 6, данные S9).

Рис. 6. Эксперимент с бактериальным заражением.

A) Количество контрольных и тетрациклиновых пчел, живущих после контакта с различными штаммами бактерий. Контрольным пчелам давали стерильный сахарный сироп в течение 5 дней, а лечебным пчелам вводили 450 мкг / мл тетрациклина в стерильном сахарном сиропе в течение 5 дней с последующим воздействием i) Serratia kz11, ii) E . coli K-12, iii) S . alvi wkB2, iv) Lactobacillus sp. wkB8, или v) без бактерий.Для каждой группы было выполнено пять повторов. Выживаемость контролировалась и регистрировалась каждый день в течение 10 дней (данные S10). B) Кривая выживаемости Каплана-Мейера, показывающая процент выживаемости контрольных пчел и пчел, получавших тетрациклин, после воздействия бактерий. Кривая выживаемости была создана с использованием GraphPad Prism. Статистический анализ проводился с использованием модели coxph, реализованной в пакете «выживаемость» [30] в R (S9 Data).

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2001861.g006

Обсуждение

Поскольку члены кишечного сообщества участвуют в мутуалистических взаимодействиях, таких как перекрестное кормление, и антагонистических взаимодействиях, таких как конкуренция и прямое убийство, реакции разных видов и генотипов на изменения окружающей среды взаимозависимы. Эти взаимодействия могут быть изменены или устранены в результате лечения антибиотиками, потенциально влияя на здоровье хозяина. Несколько исследований показали, что использование антибиотиков вызывает изменения в микробиоме человека и домашнего скота (см. Обзор [32]).У медоносных пчел и шмелей, глобально важных опылителей, кишечные сообщества участвуют как в питании, так и в защите от патогенов [19–22]. В связи с растущими доказательствами важности микробиома кишечника для здоровья животных [32] и в значительной степени необъяснимым сокращением численности пчелиных семей [18], влияние лечения антибиотиками на микробиом кишечника медоносной пчелы представляет большой интерес.

Тетрациклин, антибиотик широкого спектра действия, нацелен как на грамположительные, так и на грамотрицательные бактерии, и, таким образом, ожидается, что он затронет множество членов кишечного сообщества.Как и предполагалось, мы наблюдали существенные изменения в составе и размере кишечного микробного сообщества после лечения тетрациклином. Однако ни один из основных видов бактерий не был полностью уничтожен. Эта стойкость могла быть усилена наличием устойчивости к антибиотикам. У американских медоносных пчел основные виды микробиоты несут гены устойчивости к тетрациклину, которые сохраняются с низкой частотой даже в ульях, не прошедших в последнее время лечения антибиотиками [27]. Таким образом, мы ожидаем некоторой устойчивости к тетрациклину в наших ульях, которые не лечили более 2 лет до нашего исследования.Тем не менее, большинство основных видов уменьшились в размере и / или разнообразии после обработки. Исключение составил G . apicola , относительная численность которого, а также разнообразие штаммов увеличились после обработки. В целом влияние лечения тетрациклином на состав микробиома кишечника было более выраженным через несколько дней после прекращения лечения, вероятно, из-за замедленного действия антибиотиков. Кроме того, мертвые бактериальные клетки могли накапливаться в кишечнике из-за отсутствия дефекации, пока пчелы содержались в лабораторных клетках, из-за чего наши профили на основе ДНК не могли выявить первоначальное снижение количества живых клеток.Тем не менее, значительное сокращение общего размера сообщества наблюдалось для всех пчел, прошедших лечение, начиная с первого дня отбора проб. Более того, такой же отсроченный эффект наблюдался у обработанных пчел, содержащихся в лаборатории на протяжении всего периода восстановления.

Мы обнаружили, что пчелы, обработанные антибиотиками и вернувшиеся в улей, снизили выживаемость по сравнению с необработанными пчелами. Несколько исследований указали на роль микробиома кишечника пчел в защите от патогенов трипаносоматид [19,21,33].Одно недавнее исследование показало, что порядок колонизации симбионтов кишечника медоносных пчел влияет на восприимчивость к инфекции патогенным трипаносоматидом Lotmaria passim [21], что свидетельствует о том, что дисбактериоз кишечника способствует инвазии патогенов. Мы обнаружили повышенные уровни двух групп неосновных бактерий, Serratia и неклассифицированного Halomonadaceae , у обработанных пчел, взятых из улья; они могут представлять условно-патогенные микроорганизмы, способные проникнуть в кишечник в результате воздействия антибиотиков.Члены семейства Halomonadaceae обычно обитают в средах с высоким содержанием соли и pH, но некоторые из них были признаны патогенами человека [34,35]. Таксоны, связанные с Halomonadaceae , были обнаружены в исследованиях микробиома кишечника и пыльцы медоносных пчел, но их статус у пчел неизвестен [36]. Serratia — условно-патогенный микроорганизм человека и многих животных, включая насекомых [37,38]. Наряду с другими энтеробактериями, он широко присутствует с низкой частотой в кишечнике пчел, где считается признаком атипичного состава микробиома пчел [15,39].Следовательно, одна или обе эти бактерии могут быть ответственны за повышение нравственности обработанных пчел. Чтобы проверить это, мы подвергли леченных и контрольных пчел штамму Serratia , выделенному от медоносных пчел. Мы заметили, что воздействие Serratia привело к повышенной смертности пчел, получавших тетрациклин. Кроме того, этот штамм Serratia демонстрирует относительно высокую устойчивость к тетрациклину (подробности см. В разделе «Материалы и методы»), что позволяет предположить, что он также будет иметь избирательное преимущество во время курса лечения антибиотиками.

Дисбиоз может привести к внезапному чрезмерному росту и патогенному поведению условно-патогенных организмов (патобионтов), уже присутствующих в кишечнике [40]. Нарушения кишечного сообщества могут влиять на экспрессию генов, активность белка и общий метаболизм кишечной микробиоты [41]. Например, изменения в структуре микробного сообщества могут изменить поступление питательных веществ или вторичных метаболитов и препятствовать удалению токсичных метаболитов [42]. Метагеномный анализ колоний с расстройством коллапса колоний (CCD) показал увеличение относительной численности на G . апикола , F . перрара , S . alvi и Lactobacillus и снижает количество Alphaproteobacteria и Bifidobacteria по сравнению со здоровыми ульями [43]. Мы также наблюдали увеличение численности и разнообразия G . apicola у обработанных пчел в ульях. Эти результаты предполагают отрицательные эффекты высокой распространенности G . apicola или уменьшенной численности Bifidobacterium и Lactobacillus , которые считаются защитными для человека и других животных, включая медоносных пчел [44–46].Кроме того, пчелы с естественно приобретенными микробиомами, которых лечили антибиотиками и содержали в стерильных условиях в лаборатории, демонстрировали повышенный уровень смертности, который не наблюдался у обработанных пчел, у которых отсутствовал микробиом (пчелы без микробов), что подразумевает только дисбактериоз, а не дисбактериоз. Само лечение тетрациклином может повлиять на здоровье пчел. Хотя отсутствие эффекта на стерильных пчел предполагает, что антибиотик не оказывает прямого вредного воздействия на пчел в используемых нами концентрациях, трудно отделить влияние тетрациклина на микробиом кишечника от воздействия на хозяина, которое, в свою очередь, может изменить восприимчивость к патогенам.

Антибиотики широко используются в пчеловодстве в нескольких странах [47] и вводятся в ульи путем смешивания с сахарной пудрой, сахарным сиропом или котлетами-разбавителями. Рекомендуемое лечение включает подкормку или опудривание каждого улья примерно 200 мг / унцию тетрациклина три раза весной и осенью с интервалом в 4–5 дней. Доза, которую мы вводили в этом исследовании, была немного ниже, чем в пчеловодстве. В реальных условиях улья неясно, сколько антибиотиков будут потреблять отдельные пчелы, но вполне вероятно, что некоторые пчелы получают такие же или более высокие дозы, чем те, которые используются здесь.Кроме того, когда крапивница вводится антибиотиками, она может сохраняться в течение длительного времени. Например, тетрациклин был обнаружен в обработанных крапивницах в течение 3 месяцев после лечения [47, 48]. Следовательно, воздействие на обработанные крапивницы может быть больше, чем мы сообщаем здесь. Наши результаты показывают, что обработанные пчелы, которым позволили восстановиться в улье без дальнейшего воздействия, возвращаются к своему базовому составу микробиома через 1 неделю (рис. 3). Потенциально негативные эффекты лечения антибиотиками можно уменьшить за счет разработки альтернативных методов лечения, которые позволяют удалить антибиотик из улья по истечении определенного периода времени.

В этом исследовании мы обнаружили, что тетрациклин, широко используемый антибиотик в пчеловодстве и другом животноводстве, серьезно изменяет состав микробиома кишечника пчел и снижает выживаемость в ульях. Таким образом, эти результаты свидетельствуют о полезной роли нормального микробиома кишечника в здоровье пчел в улье. Возможное значение состоит в том, что использование антибиотиков в пчеловодстве может быть вредным из-за нарушения этих преимуществ. Мы показываем, что штамм Serratia , выделенный от пчел, вызывает повышенную смертность после лечения тетрациклином.Дисбиоз, вызванный антибиотиками, также может приводить к увеличению количества небактериальных патогенов, таких как вирусы и эукариоты, как показано для трипаносоматид [19,21]. Другие последствия дисбактериоза, такие как влияние на питание или повышенная восприимчивость к токсинам, также могут способствовать снижению выживаемости, которое мы наблюдали у пчел, получавших антибиотики. Хотя наши результаты показывают, что лечение антибиотиками может быть вредным для медоносных пчел, мы подчеркиваем, что многие другие факторы способствуют сокращению количества опылителей, которые влияют на многие популяции диких опылителей, которые не подвергаются воздействию антибиотиков [49].Следовательно, лечение антибиотиками может рассматриваться только как единственный потенциальный фактор среди множества других потенциальных виновников, включая потерю среды обитания для кормления. Более того, лечение антибиотиками иногда может быть очень полезным для предотвращения или контроля инфекций, вызываемых гнильцами [23].

В целом, наши результаты подчеркивают полезность медоносных пчел в качестве модельной системы для выявления мелкомасштабной динамики нарушенных кишечных сообществ. Кроме того, кишечная система пчелы может предоставить фундаментальную информацию о том, как лечение антибиотиками влияет на нормальную микробиоту и здоровье хозяина.

Материалы и методы

Эксперимент по восстановлению улья

Примерно 800 взрослых рабочих пчел было собрано из расплода одного улья (Big Top), содержащегося в Техасском университете в Остине (Юта). Пчел иммобилизовали при 4 ° C и пометили зеленой или розовой краской Testors. Пчелы были разделены на две группы, контрольную и экспериментальную, зеленую и розовую, соответственно, и распределяли по клеткам для чашек описанной ранее конструкции [50]. Клетки для чашек поддерживали в камерах для выращивания при температуре 35 ° C и относительной влажности 90% для имитации условий улья.Каждая клетка для чашек содержала 30 пчел, по 15 повторностей для каждого условия. Контрольным пчелам давали стерилизованный фильтром 0,5 М сахарозный сироп, а опытным пчелам давали 450 мкг / мл тетрациклина, суспендированного в стерилизованном фильтром 0,5 М сахарозном сиропе. Через 5 дней отбирали пробы у 15 пчел (по одной из каждой клетки для чашек), помещали в 100% этанол и хранили при 4 ° C. Оставшиеся пчелы (345 контрольных и 340 обработанных) были возвращены в их исходный улей. Через три дня после повторного введения в улей пчел по отдельности отлавливали и временно содержали в клетках с чашками (40 пчел на чашку) до тех пор, пока все помеченные пчелы не были извлечены из улья.После подсчета 15 помеченных пчел для контрольной и экспериментальной групп были собраны из каждого улья через 3, 5 и 7 дней после лечения антибиотиками (6–13 ноября 2015 г.), помещены в 100% этанол и хранить при 4 ° C. В течение 2 недель после сбора пчел извлекали из холодного этанола и весь кишечник от урожая до прямой кишки гомогенизировали и помещали в пробирку для взбивания шариков в 500 мкл 100% этанола молекулярной чистоты и хранили при -20 ° C. Рассечения проводились стерилизованными пламенем пинцетом в асептических условиях.ДНК была извлечена из кишечника с использованием установленных методик, было выполнено профилирование ампликона на основе Illumina области V4 гена 16S рРНК (данные S11), и размер сообщества до и после лечения был количественно определен с помощью кПЦР с использованием общего числа 16S рРНК. копий гена с поправкой на количество оперонов рРНК на геном (таблица S1).

Повторный эксперимент по выживанию улья был проведен с использованием другого улья (Chickamauga), содержащегося в UT. Приблизительно 1300 взрослых рабочих пчел были собраны из расплода в одном улье (ноябрь.1, 2016). Пчел иммобилизовали при 4 ° C и пометили зеленой или розовой краской Testors. Пчелы были разделены на две группы, контрольную и экспериментальную, розовую и зеленую, соответственно, и распределяли по клеткам для чашек. Клетки для чашек поддерживали в камерах для выращивания при температуре 35 ° C и относительной влажности 90% для имитации условий улья. Каждая клетка для чашек содержала 30 пчел, по 22 повтора для каждого условия. Контрольным пчелам давали стерилизованный фильтром 0,5 М сахарозный сироп, а экспериментальным пчелам давали 450 мкг / мл тетрациклина, суспендированного в стерилизованном фильтром 0.5 М сахарозный сироп. Через 5 дней оставшиеся пчелы (622 контрольных и 623 обработанных) были возвращены в их исходный улей. После возвращения в улей выживаемость после обработки в улье оценивалась путем подсчета пчел на день 3. Мы по отдельности ловили пчел и временно держали их в клетках для чашек (40 на чашку) до тех пор, пока все помеченные пчелы не были восстановлены.

В лабораторном эксперименте по восстановлению

Одну рамку для расплода удалили из улья (Big Top) в университетском городке UT и поместили в камеру для выращивания при 35 ° C и влажности 90%.Куколкам давали возможность вырасти естественным путем, и только что появившиеся взрослые особи (NEW) были собраны через 24 часа. Приблизительно 600 NEW были помечены желтой краской Testors и возвращены в их первоначальный улей для естественного накопления их микробиоты. После 7 дней пребывания в улье было повторно поймано около 450 пчел. Затем их ненадолго иммобилизовали при 4 ° C и разделили на две группы: контрольную и лечебную. Этих пчел помещали в клетки-чашки и содержали в камерах для выращивания. Каждая клетка для чашек содержала приблизительно 22 пчелы (десять повторностей для каждого условия).Контрольным пчелам давали стерилизованный фильтром 0,5 М сахарозный сироп, а опытным пчелам давали 450 мкг / мл тетрациклина, суспендированного в стерилизованном фильтром 0,5 М сахарозном сиропе. Все мертвые пчелы удалялись во время ежедневной переписи. Через 5 дней из каждой группы обработки отбирали образцы у десяти пчел (по одной из каждой клетки для чашек), помещали в 100% этанол и хранили при 4 ° C, а оставшихся пчел охлаждали и случайным образом перераспределяли в новые клетки для чашек. Затем пчелам позволяли «восстановиться» в следующих условиях: i) воздействие, i.д., с нормальными рабочими, собранными из их улья (15 на клетку для чашек), или ii) стерильными, то есть содержаться только с другими пчелами из их группы, получавшими тетрациклин. Десять пчел были собраны из каждой из четырех групп (i) контрольная, подвергавшаяся обработке, ii) контрольная стерильная, iii) обработанная, iv) обработанная стерильность в моменты времени 0, 3, 5 и 7 дней после обработки антибиотиками (ноябрь. 3–10, 2015) помещали в 100% этанол и хранили при 4 ° C. В течение 2 недель после сбора пчел извлекали из холодного этанола, весь кишечник от урожая до прямой кишки гомогенизировали и помещали в пробирку для взбивания шариков в 500 мкл 100% этанола молекулярной чистоты и хранили при -20 ° C.Рассечения проводились стерилизованными пламенем пинцетом в асептических условиях. ДНК была извлечена из кишечника (см. Ниже), было выполнено профилирование ампликонов на основе Illumina копий гена 16S рРНК, и общий размер сообщества до и после обработки был количественно определен с помощью кПЦР с использованием количества копий гена 16S рРНК (с поправкой на количество оперонов рРНК на геном). Чтобы сравнить различия в эффектах выживаемости в улье и в лаборатории, выживаемость пчел, содержащихся в лаборатории, также измеряли на 3 дня после обработки.

Анализ выживаемости без микробов

Рамка расплода была собрана из улья в UT (Blueberry). Куколки поздней стадии (глаза пигментированы, но куколки не двигались) удаляли из этих рамок и помещали на ватные диски в стерильные пластиковые контейнеры. Их помещали в камеры для выращивания при 35 ° C и высокой влажности (~ 90% относительной влажности), чтобы имитировать условия улья, и куколкам позволяли развиваться естественным образом. После закрытия NEWs ненадолго иммобилизовали при 4 ° C, и бункеры были объединены для рандомизации потенциальных возрастных изменений.Затем NEW помещали в клетки для чашек и выдерживали в камерах для выращивания. Каждая клетка для чашек содержала приблизительно 13 пчел (четыре одинаковых чашки для каждого условия). Контрольным пчелам скармливали стерилизованный фильтром 0,5 М сахарозный сироп и стерильный пчелиный хлеб, а экспериментальным пчелам давали 450 мкг / мл тетрациклина, суспендированного в стерилизованном фильтром 0,5 М сахарозном сиропе и стерильном пчелином хлебе. Все мертвые пчелы удалялись во время ежедневной переписи. Через 5 дней обработка тетрациклином была остановлена, и всех пчел кормили стерилизованными фильтром 0.5 M сахарозного сиропа и стерильный пергамент. Выживаемость стерильных пчел измеряли на 3 дня после обработки путем подсчета общего числа живых пчел для каждой группы (контроль и обработка).

Извлечение ДНК

Для извлечения ДНК из тканей пчел мы использовали взбивание шариков с бромидом цетилтриметиламмония (ЦТАБ), метод, описанный в [11], со следующими модификациями: после взбивания шариков образцы оставляли на короткое время при 56 ° C, в то время как пена осела. Затем мы добавили 1 мкл раствора РНКазы A (Sigma), ненадолго встряхнули пробирки и оставили их на ночь при 56 ° C.Затем мы добавляли 0,75 мл фенол-хлороформ-изоамилового спирта (25: 24: 1) (Ambion, Остин, Техас, США) в каждую пробирку, встряхивали в течение 30 с, а затем помещали на лед не менее 2 минут, а затем центрифугировали при полной температуре. скорость 30 мин при 4 ° C. Водную фазу осаждали в спирте, промывали и сушили на воздухе, затем ресуспендировали в 50 мкл воды, свободной от нуклеаз.

Количественная ПЦР для оценки численности бактерий

Мы амплифицировали полные копии гена 16S рРНК с использованием универсальных бактериальных праймеров с помощью прибора Eppendorf Mastercycler ep realplex (Eppendorf, Hauppauge, NY, USA).Прямой праймер был 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ’), а обратный праймер — 355R (5’-CTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’). Реакции (10 мкл) проводили в трех повторностях с 5 мкл iTaq universal SYBR Green (Bio-Rad, Inc.), 1 мкл (каждый) 3 мкМ праймера, 2 мкл H 2 O и 1 мкл матричной ДНК, которая был разбавлен в 100 раз. Цикл ПЦР составлял 95 ° C (3 мин), за ним следовали 40 циклов 95 ° C (3 с) и 60 ° C (20 с). Используя стандартные кривые амплификации клонированной целевой последовательности в векторе pGEM-T (Promega, Madison, WI, US), мы рассчитали абсолютное количество копий для реакционной матрицы, а затем скорректировали его на основе разведения для расчета общего количества копий для каждого образца. .

Секвенирование Illumina

ПЦР-амплификации области V4 гена 16S рРНК проводили в трех повторах с использованием праймеров 515F и 806R, как описано ранее [51]. Продукты реакции очищали с помощью гранул AMPure XP (Beckman Coulter). Полученные ампликоны подвергали секвенированию Illumina на платформе MiSeq (цикл секвенирования 2×250) в Центре секвенирования и анализа генома в UT.

Анализ последовательности

считывания последовательностей Illumina были обработаны в QIIME [52].Файлы FASTQ были отфильтрованы по качеству с помощью split_libraries_fastq.py, что позволило получить минимальный показатель качества Phred Q20. Прямые и обратные чтения Illumina были объединены с помощью join_paired_ends.py с настройками по умолчанию. Химерные последовательности были удалены с помощью метода обнаружения usearch6.1, реализованного в скрипте identify_chimeric_seqs.py в QIIME. OTU были сгруппированы на 97% и 99% с использованием алгоритма UCLUST, реализованного в pick_open_reference_otus.py. Вкратце, считывания последовательностей первоначально были сгруппированы по выпуску июльского 2015 года набора справочных данных SILVA [53] (http: // www.arb-silva.de/download/arb-files). Последовательности, которые не соответствовали набору данных SILVA, впоследствии были кластеризованы в de novo OTU с помощью UCLUST. Неназначенные чтения митохондрий и хлоропластов были удалены из набора данных. Для устранения ошибок пиросеквенирования все OTU, присутствующие в количестве менее 0,1%, удаляли. Поскольку доступные в настоящее время курируемые базы данных последовательностей 16S рРНК не содержат эталонных последовательностей для основных видов микробиоты кишечника медоносных пчел, таксономическое определение было выполнено с использованием локальной базы данных BLAST эталонных последовательностей гена 16S рРНК бактерий пчел.

Последующий анализ, включая оценки альфа- и бета-разнообразия, был проведен с использованием рабочего процесса QIIME core_diversity_analysis.py с глубиной выборки 5000 считываний на выборку и параметрами по умолчанию. Глубина разрежения была выбрана вручную, чтобы исключить образцы с исключительно низкими общими последовательностями (подробные сведения об образцах см. В разделе «Данные S11»). Абсолютную численность каждого вида бактерий оценивали путем умножения общего числа генов 16S рРНК (измеренного с помощью кПЦР и корректировки оперонов рРНК на геном) на процент относительной численности каждого вида.Количество оперонов 16S рРНК определяли с использованием эталонного генома для данного вида бактерий пчелиного кишечника, если таковой имеется. Когда полные геномы были недоступны, среднее количество копий оперона 16S рРНК для бактериального рода или семейства было получено из rrnDB (https://rrndb.umms.med.umich.edu/) и использовано в качестве оценки количества копий. (Таблица S1). Статистические тесты проводились с использованием критерия суммы рангов Вилкоксона и критерия хи-квадрат, реализованного в R.

.

Экран от грибков

Пчелы-восстановители улья (Big Top) (все лечебные и контрольные пчелы из d 0, 3, 5 и 7) были проверены на наличие грибов с помощью диагностической ПЦР с универсальными грибковыми праймерами ITS1-F (5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA- 3 ‘) и LR3-R (5’-GGTCCGTGTTTCAAGAC-‘3) [54,55].ПЦР-анализы включали положительный (очищенная ДНК Saccharomyces cerevisiae ) и отрицательный (ddH 2 O) контроли. ПЦР-амплификацию продуктов ДНК проводили с использованием Taq-полимеразы (TaKaRa, Япония). ПЦР-амплификацию проводили следующим образом: 94 ° C в течение 4 мин и 40 циклов по 30 с при 94 ° C, 30 с при 55 ° C и 1 мин при 72 ° C; и 72 ° C в течение 10 мин. После завершения ПЦР 5 мкл образцов подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле, чтобы определить, была ли амплифицирована представляющая интерес ДНК.Затем амплифицированные продукты очищали с использованием гранул AMPure XP (Beckman Coulter) и клонировали с использованием pGEM-T Easy Vector Systems (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) в соответствии с инструкциями производителя. Рекомбинантные плазмиды трансформировали в компетентные E . coli DH5α. Трансформацию высевали на агар LB, содержащий по 100 мг / л ампициллина, IPTG и X-gal. Белые колонии подвергали скринингу с использованием ПЦР с праймерами, специфичными для плазмидных вставок Т7 (5´-TAATACGACTCACTATAGGG-3´) и SP6 (5´-ATTTAGGTGACACTATAG-3´).ПЦР-амплификацию проводили следующим образом: 95 ° C в течение 2 мин. и 28 циклов по 10 сек. при 95 ° C, 20 сек. при 46 ° C и 90 сек. при 68 ° С; и 68 ° C в течение 1 мин. В общей сложности 20 клонов были отобраны случайным образом, и вставки были секвенированы на обоих концах с использованием служб секвенирования по Сэнгеру в Центре секвенирования ДНК (DSF) в UT. После обрезки было сохранено 34 высококачественных конечных последовательности. Эти считывания с конца использовались в качестве запросов при поиске BLASTn в базе данных неизбыточных нуклеотидов NCBI.

Выделение

Serratia из микробиома кишечника медоносной пчелы

Пакет с пчелами был куплен на коммерческой пасеке, где не применяют антибиотики или другие химические вещества.Пакет рабочих продержали в лаборатории примерно один месяц и снабдили 0,5 М раствором сахарозы. Сотни пчел препарировали в разные моменты времени, гомогенизировали и консервировали в 20% глицерине при -80 ° C. Затем гомогенизированные кишки высевали на чашки с агаром для инфузии сердца с овечьей кровью и помещали при 37 ° C в камеру с 5% CO 2 на ночь. Отдельные бактериальные колонии выделяли и хранили в 20% глицерине при -80 ° C. Затем очищенные изоляты амплифицировали с помощью ПЦР с универсальными бактериальными праймерами 27F и 1492R [56] и секвенировали по Сэнгеру в центре секвенирования ДНК (DSF) в UT.Последовательности были идентифицированы с помощью поиска BLAST в базе данных неизбыточных нуклеотидов NCBI. Один штамм Serratia был выбран в качестве потенциального патогена для экспериментов по заражению (kz11). Serratia kz11 тестировалась на устойчивость к тетрациклину на основе метода минимальной ингибирующей концентрации (МИК) с использованием тест-полосок 0,016–256 мкг / мл (bioMérieux). Вкратце, Serratia kz11 наносили на пластины LB. Когда поверхность каждой пластины высохла, на каждую пластину помещали по одной тест-полоске для Е-теста.Планшеты инкубировали крышкой вверх при 37 ° C в течение приблизительно 24 часов. МИК считывали непосредственно с тест-полоски в соответствии с инструкциями производителя, где эллиптическая зона ингибирования пересекалась со шкалой МИК на полоске. МИК была> 32 мкг / мл для Serratia kz11. Отметим, что известны неустойчивые штаммы Serratia с МПК <1 [57].

Serratia Эксперимент по заражению рабочих с контролируемым возрастом

Одну рамку для расплода удалили из улья (Whiskeytown) в университетском городке UT и поместили в камеру для выращивания при 35 ° C и влажности 90%.Куколкам давали возможность появиться естественным путем, и NEW собирали через 24 часа. Всего появилось 720 NEW, которые были распределены по клеткам для чашек и скармливались свежеприготовленным гомогенатом задней кишки рабочих в дополнение к их пище, что позволяет NEWs получить свой основной состав микробиома [11]. Каждая клетка для чашек содержала приблизительно 45 пчел (16 одинаковых чашек). Через 6 дней пчел иммобилизовали при 4 ° C, разделили на группы (контроль и лечение) и распределили по клеткам для чашек. Чашечные клетки содержались, как описано выше, в камерах для выращивания, имитирующих условия улья.Каждая клетка для чашек содержала примерно 43 пчелы, по восемь экземпляров для каждого условия. Контрольным пчелам давали стерилизованный фильтром 0,5 М сахарозный сироп, а опытным пчелам давали 450 мкг / мл тетрациклина, суспендированного в стерилизованном фильтром 0,5 М сахарозном сиропе. Через 5 дней лечение тетрациклином было прекращено. Через день пчел охлаждали, случайным образом перераспределяли в новые клетки для чашек и подвергали воздействию Serratia kz11 или кормили только стерильным сахарным сиропом и стерильным пчелиным хлебом. В результате получилось четыре группы с примерно 150 пчелами (пять повторных чашек с примерно 30 пчелами на чашку) в каждой группе: 1) контроль (№ Serratia ), 2) контроль + Serratia kz11, 3) пост- лечение (№ Serratia ), 4) последующее лечение + Serratia kz11.Учет пчел проводился каждый день в течение десяти дней после заражения бактериями. Кривые выживаемости Каплана-Мейера были построены в GraphPad Prism версии 7.0b для Mac OS X, GraphPad Software, Ла-Хойя, Калифорния, США, www.graphpad.com. Статистический анализ проводился в R с использованием модели пропорциональных рисков Кокса (coxhp), реализованной в пакете «выживаемость» [30].

Эксперимент по заражению Serratia на рабочих, не контролируемых по возрасту

Примерно 600 взрослых рабочих пчел было собрано из расплода в улье (Big Top), содержащемся в UT (июль.21, 2016). Пчел иммобилизовали при 4 ° C, разделили на группы (контроль и лечение) и распределили по клеткам с чашечками описанной ранее конструкции [50]. Чашечные клетки содержались, как описано выше, в камерах для выращивания, имитирующих условия улья. Каждая клетка для чашек содержала 20 пчел, по 15 повторностей для каждого условия. Контрольным пчелам давали стерилизованный фильтром 0,5 М сахарозный сироп, а опытным пчелам давали 450 мкг / мл тетрациклина, суспендированного в стерилизованном фильтром 0,5 М сахарозном сиропе. Через 5 дней лечение тетрациклином было прекращено.Через день после прекращения лечения тетрациклином пчел охлаждали, случайным образом перераспределяли в новые клетки для чашек и подвергали воздействию Serratia kz11, выделенного из кишок медоносных пчел, или кормили только стерильным сахарным сиропом и стерильным пчелиным хлебом. В результате получилось четыре группы по 100 пчел (пять повторных чашек примерно с 20 пчелами на чашку) в каждой группе: 1) контроль (№ Serratia ), 2) контроль + Serratia kz11, 3) после обработки. (№ Serratia ) и 4) после обработки + Serratia kz11.Перепись и статистический анализ были такими же, как и в эксперименте на пчелах с контролируемым возрастом, описанном выше.

Эксперимент с бактериальным заражением

Примерно 1800 взрослых рабочих пчел были собраны из расплода из улья (Whiskeytown), содержащегося в кампусе UT (14 ноября 2016 г.). Пчел иммобилизовали при 4 ° C, разделили на группы (контроль и лечение) и распределили по клеткам для чашек. Чашечные клетки содержались, как описано выше, в камерах для выращивания, имитирующих условия улья.Каждая клетка для чашки содержала 45 пчел, по 20 повторностей для каждого условия. Контрольным пчелам давали стерилизованный фильтром 0,5 М сахарозный сироп, а опытным пчелам давали 450 мкг / мл тетрациклина, суспендированного в стерилизованном фильтром 0,5 М сахарозном сиропе. Через 5 дней лечение тетрациклином было прекращено. Через день после прекращения лечения тетрациклином (День 1) пчел охлаждали, случайным образом перераспределяли в новые клетки для чашек и подвергали воздействию i) S . alvi wkB2, ii) Lactobacillus sp.wkB8, iii) E . coli K-12, iv) Serratia kz11, или v) без бактерий (контроль). В результате получилось всего десять групп с примерно 170 пчелами (шесть повторяющихся чашек с примерно 28 пчелами на чашку) в каждой группе: 1) контроль (№ Serratia ), 2) контроль + Serratia kz11, 3) контроль + Lactobacillus sp. wkB8, 4) контроль + S . alvi , 5) контроль + E . coli , 6) после обработки (№ Serratia ), 7) после обработки + Serratia kz11, 8) после обработки + Lactobacillus sp.wkB8, 9) после обработки + S . alvi и 10) после обработки + E . coli . Перепись и статистический анализ были такими же, как и в эксперименте на пчелах с контролируемым возрастом, описанном выше.

Бактериальное культивирование и введение

Serratia kz11 и E . coli K-12 выращивали в жидкой среде LB при 37 ° C в течение ночи. S . alvi wkB2 выращивали в Insectagro (Corning) в течение 3 дней при 37 ° C в 5% CO. 2 . Lactobacillus sp. wkB8 выращивали в бульоне MRS в течение 3 дней при 37 ° C в 5% CO 2 . Измеряли оптическую плотность 600 нм для каждой бактериальной культуры, и клетки промывали три раза PBS и разбавляли до концентрации 0,5 OD в стерильном сахарном сиропе или в PBS. Растворы бактерий-PBS наносили на стерильный пчелиный хлеб (облученный гамма-излучением) в кормушках, которые помещали в клетки для чашек, а растворы бактерий-сахарного сиропа вводили в пузырьки для кормления на 1-й день после лечения тетрациклином.

Чтобы определить, как долго жизнеспособные бактериальные клетки оставались на пергах, кормушки (десять на обработку бактериями) заполняли стерильным пчелиным хлебом и инокулировали бактериями, суспендированными в PBS, в концентрации 0,5 OD. Контрольный пчелиный хлеб инокулировали только PBS. Каждый день отбирали пробы из одного желоба, смешивали с 500 мкл PBS и высевали в трех экземплярах (агар LB для Serratia kz11 и E .9 coli K-12, агар для инфузии сердца (Difco) с добавлением 5% овец. кровь для S . alvi wkB2, агар MRS для Lactobacillus sp. wkB8, и по одному каждого элемента управления). Планшеты проверяли на рост бактерий через 24 часа при 37 ° C ( Serratia и E , coli ) или 72 часа при 37 ° C в 5% CO 2 ( S . alvi и Lactobacillus ). Жизнеспособные клетки были обнаружены для i) Serratia kz11 до дня 2, ii) Lactobacillus sp. нед.в8 до дня 3, iii) S . alvi неделя B2 до 3-го дня и iv) E . coli K-12 до дня 4. Жизнеспособные клетки никогда не выделяли из контрольной (1) пчелы.

Регистрационный номер нуклеотидной последовательности

считывания гена 16S рРНК депонированы в биопроекте чтения последовательности NCBI: PRJNA338694.

Дополнительная информация

S1 Рис. Влияние лечения тетрациклином на относительную численность восьми основных кишечных бактерий.

A) Диаграммы с накоплением в столбцах, показывающие относительную численность видов бактерий в кишечнике пчел у контрольных пчел (n = 14) и пчел, подвергшихся лечению (n = 15), после пяти дней лечения тетрациклином (день 0 после лечения), см. Набор данных S7 для детали образца.B) Коробчатые диаграммы, показывающие относительную численность восьми основных видов кишечных пчел у контрольных и экспериментальных пчел в день 0. Ни один из восьми основных видов не показал значительных изменений в относительной численности после воздействия тетрациклина в день 0 (NS = не значимо, сумма рангов Вилкоксона тестовое задание). См. Данные об относительной численности в S1 Data.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2001861.s001

(PDF)

S2 Рис. Влияние обработки тетрациклином на выживаемость, представленное в виде общего числа и процента пчел, выживающих на 3-й день после обработки.

A) Количество пчел, извлеченных из эксперимента с ульем 2. B) Выживаемость в лабораторном эксперименте по извлечению. C) Выживание в лабораторных стерильных пчелах эксперимента по восстановлению. Г) Выживание в лабораторных стерильных пчелах. *** = P <0,0001, NS = не значимо, критерий хи-квадрат. См. Данные S2 для подсчета выживаемости.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2001861.s002

(PDF)

S3 Рис. Влияние лечения тетрациклином на абсолютную численность пяти представителей основного кишечного сообщества пчел на 3-й, 5-й и 7-й день после лечения.

Коробчатые диаграммы показывают, что воздействие тетрациклина снижает численность этих групп, по оценке количественной ПЦР, во все моменты времени после обработки. A) Bifidobacterium , B) Lactobacillus Firm-5, C) Lactobacillus Firm-4, D) Snodgrassella , E) Bartonella . ** = P <0,001, *** = P <0,0001, критерии суммы рангов Вилкоксона. См. Данные об абсолютной численности в S1 Data.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2001861.s003

(PDF)

S4 Фиг.Влияние лечения тетрациклином на абсолютную численность пяти бактериальных групп на 3-й, 5-й и 7-й день после лечения.

Коробчатые диаграммы показывают сдвиги в численности, по оценке количественной ПЦР, по крайней мере, в одну временную точку после обработки. AB) Обилие двух основных кишечных бактерий пчелы (Alpha 2.1 и Frischella ) уменьшилось после обработки тетрациклином, C) Экологическая бактерия Lactobacillus kunkeei уменьшилась на 3-й и 5-й дни. DE) Две условно-патогенные бактерии, неклассифицированный представитель Halomonadaceae family и Serratia , значительно увеличились после лечения тетрациклином на третий и пятый день, соответственно.* = P <0,05, ** = P <0,001, критерии суммы рангов Вилкоксона. См. Данные об абсолютной численности в S1 Data.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2001861.s004

(PDF)

S5 Рис. Влияние обработки тетрациклином на состав кишечного микробиома пчел, содержащихся в лабораторных камерах для выращивания, на 3, 5 и 7 дни после обработки.

A) Наборные столбчатые графики, показывающие абсолютную численность (количественная ПЦР с поправкой на количество копий гена рРНК) видов бактерий для пчел, содержащихся в стерильных экспериментальных условиях на 3-й день (обработка n = 9, контроль n = 9), 5-й день (обработка n = 9, контроль n = 8) и день 7 (обработка n = 10, контроль n = 10), см. данные S11 для получения информации об образце и данные S12 для абсолютной и относительной численности.График справа показывает общее количество копий гена 16S рРНК. У экспериментальных пчел было меньше бактериальных клеток, чем у контрольных пчел во все моменты времени. B) Диаграммы с накоплением в столбцах, показывающие абсолютное количество видов бактерий для пчел, содержащихся в экспериментальных условиях, на 3-й день (обработка n = 9, контроль n = 10), день 5 (обработка n = 9, контроль n = 9) и День 7 (обработка n = 8, контроль n = 10), см. Данные S11 для получения подробной информации об образце и S13 Data для абсолютной и относительной численности. График справа показывает общее количество копий гена 16S рРНК.У экспериментальных пчел было меньше бактериальных клеток, чем у контрольных пчел на 3-й и 5-й дни после обработки. * = P <0,05, ** = P <0,001, критерии суммы рангов Вилкоксона.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2001861.s005

(PDF)

S6 Рис. Экран от грибков в ульях пчел.

A) Процент пчел в эксперименте с ульем, положительных на грибки, на основании диагностической ПЦР с универсальными грибковыми праймерами на 0, 3, 5 и 7 дни после обработки. В день 0 ни один из образцов не был положительным на грибы.На 3-й день четыре экспериментальных пчелы (26%) были положительными на грибки, а на 5-й день восемь экспериментальных пчел (53%) были положительными на грибки, а на 7-й день две экспериментальные пчелы (13%) были положительными на грибы на основании диагностических данных. ПЦР. Одна контрольная пчела была положительной на наличие грибов на 7-й день. B) Идентичность случайно секвенированных клонов от экспериментальных и контрольных пчел.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2001861.s006

(PDF)

S9 Рис. Анализ главных координат.

Анализ основных координат (взвешенный и невзвешенный Unifrac) состава микробиома кишечника контрольных и лечебных пчел, содержащихся в A-B) стерильных экспериментальных условиях или C-D) экспериментальных условиях, подвергшихся воздействию, на 0, 3, 5 и 7 дни после обработки.Данные по альфа- и бета-разнообразию см. В разделе «Данные S14».

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2001861.s009

(PDF)

Благодарности

Мы благодарим Кима Хаммонда за помощь в пчеловодстве, сотрудников лаборатории Морана и лаборатории Охмана за конструктивные предложения, а также Центр секвенирования и анализа генома UT за услуги по секвенированию.

Ссылки

  1. 1. Lozupone CA, Stombaugh JI, Gordon JI, Jansson JK, Knight R. Разнообразие, стабильность и устойчивость микробиоты кишечника человека.Природа. 2012; 489: 220–230. pmid: 22972295
  2. 2. Детлефсен Л., Хусе С., Согин М.Л., Релман Д.А. Всестороннее воздействие антибиотика на микробиоту кишечника человека, что выявлено глубоким секвенированием 16S рРНК. PLoS Biol. 2008; 6: e280. pmid: 161
  3. 3. Нг К.М., Феррейра Дж. А., Хиггинботтом С. К., Линч Дж. Б., Кашьяп П.С., Гопинатх С. и др. Высвобожденные микробиотой сахара хозяина способствуют распространению кишечных патогенов после приема антибиотиков. Природа. 2013; 502: 96–99. pmid: 23995682
  4. 4.Buffie CG, Jarchum I, Equinda M, Lipuma L, Gobourne A, Viale A и др. Глубокие изменения кишечной микробиоты после однократного приема клиндамицина приводят к устойчивой восприимчивости к колиту, индуцированному Clostridium difficile . Заражение иммунной. 2012; 80: 62–73. pmid: 22006564
  5. 5. Стечер Б., Роббиани Р., Уокер А.В., Вестендорф А.М., Бартел М., Кремер М. и др. Salmonella enterica serovar typhimurium использует воспаление, чтобы конкурировать с кишечной микробиотой.PLoS Biol. 2007; 5: 2177–2189. pmid: 17760501
  6. 6. Секиров И., Там Н.М., Йогова М., Робертсон М.Л., Ли Ю., Лупп С. и др. Вызванные антибиотиками нарушения микробиоты кишечника изменяют восприимчивость хозяина к кишечной инфекции. Заражение иммунной. 2008. 76: 4726–4736. pmid: 18678663
  7. 7. Детлефсен Л, Релман Д.А. Неполное восстановление и индивидуальные ответы микробиоты дистальных отделов кишечника человека на повторяющееся воздействие антибиотиков. Proc Natl Acad Sci USA. 2011; 108: 4554–4561.pmid: 20847294
  8. 8. Blaser MJ. Использование антибиотиков и его последствия для нормального микробиома. Наука. 2016; 352: 544–545. pmid: 27126037
  9. 9. Лей Р. Э., Петерсон Д. А., Гордон Д. И.. Экологические и эволюционные силы, формирующие микробное разнообразие в кишечнике человека. Клетка. 2006; 124: 837–848. pmid: 16497592
  10. 10. Бэкхед Ф., Лей Р. Э., Зонненбург Дж. Л., Петерсон Д. А., Гордон Д. И.. Хозяин-бактериальный мутуализм в кишечнике человека. Наука. 2005; 307: 1915–1920.pmid: 157
  11. 11. Пауэлл Дж. Э., Мартинсон В. Г., Урбан-Мид К., Моран Н. А.. приобретения микробиоты кишечника медоносной пчелы Apis mellifera . Appl Environ Microbiol. 2014; 80: 7378–7387. pmid: 25239900
  12. 12. Квонг В.К., Моран Н.А. Сообщества кишечных микробов социальных пчел. Nat Rev Microbiol. 2016; 14: 374–384. pmid: 27140688
  13. 13. Пауэлл Дж. Э., Ратнаеке Н., Моран Н. А.. Разнообразие штаммов и специфичность хозяина в специализированном кишечном симбионте медоносных пчел и шмелей.Mol Ecol. 2016; 25: 4461–4471. pmid: 27482856
  14. 14. Сабри З.Л., Хансен А.К., Моран Н.А. Независимые исследования с использованием глубокого секвенирования позволили выявить тот же набор основных видов бактерий, доминирующих в кишечных сообществах медоносных пчел. PLoS ONE. 2012; 7: e41250. pmid: 22829932
  15. 15. Моран Н.А., Хансен А.К., Пауэлл Дж.Э., Сабри З.Л. Отличительная микробиота кишечника медоносных пчел оценивалась с помощью глубокого отбора проб у отдельных рабочих пчел. PLoS ONE. 2012; 7: e36393. pmid: 22558460
  16. 16.Gallai N, Salles J-M, Settele J, Vaissiere BE. Экономическая оценка уязвимости мирового сельского хозяйства в условиях сокращения количества опылителей. Ecol Econ. 2009. 68: 810–821.
  17. 17. Кокс-Фостер Д.Л., Конлан С., Холмс Е.С., Паласиос Г., Эванс Д.Д., Моран Н.А. и др. Метагеномное исследование микробов при разрушении колонии медоносных пчел. Наука. 2007. 318: 283–287. pmid: 17823314
  18. 18. Поттс С.Г., Бисмейер Дж.К., Кремен С., Нойман П., Швайгер О., Кунин В.Е.Уменьшение количества глобальных опылителей: тенденции, воздействия и движущие факторы. Trends Ecol Evol. 2010. 25: 345–353. pmid: 20188434
  19. 19. Кох Х., Шмид-Хемпель П. Социально передаваемая кишечная микробиота защищает шмелей от кишечных паразитов. Proc Natl Acad Sci USA. 2011; 108: 19288–19292. pmid: 22084077
  20. 20. Энгель П., Мартинсон В.Г., Моран Н.А. Функциональное разнообразие простой кишечной микробиоты медоносной пчелы. Proc Natl Acad Sci USA. 2012; 109: 11002–11007. pmid: 22711827
  21. 21.Шварц Р., Моран Н.А., Эванс Дж. Д.. Ранние колонизаторы кишечника формируют восприимчивость к паразитам и состав микробиоты у рабочих медоносных пчел. Proc Natl Acad Sci USA. 2016; 113: 9345–9350. pmid: 27482088
  22. 22. Ли Ф.Дж., Руш Д.Д., Стюарт Ф.Дж., Маттила Х.Р., Ньютон ИЛГ. Расщепление и ферментация сахаридов микробиомом кишечника медоносной пчелы. Environ Microbiol. 2015; 17: 796–815. pmid: 242
  23. 23. Уилсон WT. Обзор гнилец в Соединенных Штатах: последние 45 лет.Культ пчелы. 2000; 128: 24–28.
  24. 24. Эванс Дж. Д. Различное происхождение устойчивости к тетрациклину у бактериального патогена медоносной пчелы Paenibacillus larvae . J Invertebr Pathol. 2003; 83: 46–50. pmid: 12725811
  25. 25. Генерш Э. Американский гнилец у медоносных пчел и его возбудитель, Paenibacillus larvae . J Invertebr Pathol. 2010; 103: S10 – S19. pmid: 191
  26. 26. Woolhouse M, Ward M, van Bunnik B, Farrar J. Устойчивость к противомикробным препаратам у людей, домашнего скота и окружающей среды в целом.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2015; 370: 20140083–20140083. pmid: 251
  27. 27. Тиан Б., Фадил Н.Х., Пауэлл Дж. Э., Квонг В. К., Моран Н. А.. Длительное воздействие антибиотиков привело к накоплению детерминант устойчивости в микробиоте кишечника медоносных пчел. mBio. 2012; 3: e00377–12. pmid: 23111871
  28. 28. Мияги Т., Пэн С., Чуанг Р.Й., Массен Е.К., Спивак М.С., Дои Р.Х. Подтверждение устойчивости к окситетрациклину американского патогена гнильца Paenibacillus larvae в США.J Invertebr Pathol. 2000. 75: 95–96. pmid: 10631065
  29. 29. Lozupone C, Knight R. UniFrac: новый филогенетический метод сравнения микробных сообществ. Appl Environ Microbiol. 2005; 71: 8228–8235. pmid: 16332807
  30. 30. Therneau TM, Lumley T. Пакет «выживания». 2016. https://cran.r-project.org/web/packages/survival/index.html
  31. 31. Blattner FR, Plunkett G, Bloch CA, Perna NT, Burland V, Riley M и др. Полная последовательность генома Escherichia coli K-12.Наука. 1997; 277: 1453–1462. pmid: 03
  32. 32. Робинсон CJ, Боханнан BJM, Молодой В.Б. От структуры к функции: экология микробных сообществ, связанных с хозяином. Microbiol Mol Biol Rev.2010; 74: 453–476. pmid: 20805407
  33. 33. Кариво Д.П., Пауэлл Дж. Э., Кох Х., Винфри Р., Моран Н. А.. Изменения в микробных сообществах кишечника и их связь с инфекцией патогенов у диких шмелей ( Bombus ). ISME J. 2014; 8: 2369–2379. pmid: 24763369
  34. 34.Стивенс Д.А., Гамильтон-младший, Джонсон Н., Ким К.К., Ли Дж.С. Halomonas , недавно признанный патоген человека, вызывающий инфекции и заражение в диализном центре: три новых вида. Медицина (Балтимор). 2009. 88: 244–249.
  35. 35. Kim KK, Lee KC, Oh H-M, Lee J-S. Halomonas stevensii sp. nov., Halomonas hamiltonii sp. ноя и Halomonas johnsoniae sp. nov., выделено из отделения почечной терапии. Int J Syst Evol Microbiol.2010. 60: 369–377. pmid: 19651714
  36. 36. Андерсон К.Е., Шихан Т.Х., Мотт Б.М., Маес П., Снайдер Л., Шван М.Р. и др. Микробная экология улья и ландшафт опыления: бактериальные ассоциаты цветочного нектара, пищеварительного тракта и хранимой пищи медоносных пчел ( Apis mellifera ). PLoS ONE. 2013; 8: e83125. pmid: 24358254
  37. 37. Булла Л.А. Младший, Родс Р.А., Сент-Джулиан Дж. Бактерии как возбудители насекомых. Annu Rev Microbiol. 1975. 29: 163–90. pmid: 1180511
  38. 38.Гримонт П.А., Гримонт Ф. Род Serratia. Annu Rev Microbiol. 1978; 32: 221–248. pmid: 360966
  39. 39. Ли Дж., Пауэлл Дж. Э., Го Дж., Эванс Дж. Д., Ву Дж., Уильямс П. и др. Два энтеротипа кишечного сообщества повторяются у разных видов шмелей. Curr Biol. 2015; 25: R652 – R653. pmid: 26241138
  40. 40. Фам Тан, Лоули Т.Д. Новые сведения о дисбактериозе кишечника при бактериальных инфекциях. Curr Opin Microbiol. 2014; 17: 67–74. pmid: 24581695
  41. 41. Franzosa EA, Hsu T, Sirota-Madi A, Shafquat A, Abu-Ali G, Morgan XC и др.Секвенирование и не только: интеграция молекулярных «омиков» для профилирования микробного сообщества. Nat Rev Microbiol. 2015; 13: 360–372. pmid: 256
  42. 42. Уиллинг Б.П., Рассел С.Л., Финли ББ. Сдвиг баланса: влияние антибиотиков на взаимное влияние микробиоты и хозяина. Nat Rev Microbiol. 2011; 9: 233–243. pmid: 21358670
  43. 43. Корнман Р.С., Тарпи Д.Р., Чен Й., Джеффрис Л., Лопес Д., Петтис Дж. С. и др. Патогенные сети в разрушающихся семьях медоносных пчел. PLoS ONE. 2012; 7: e43562 – e43562.pmid: 221
  44. 44. Сервин А.Л. Антагонистическая активность лактобацилл и бифидобактерий против микробных патогенов. FEMS Microbiol Rev.2004; 28: 405–440. pmid: 15374659
  45. 45. Olofsson TC, Vásquez A. Обнаружение и идентификация новой молочнокислой бактериальной флоры в медовом желудке пчелы Apis mellifera. Curr Microbiol. 2008. 57: 356–363. pmid: 18663527
  46. 46. Васкес А., Форсгрен Э., Фрис И., Пакстон Р.Дж., Флаберг Э., Секели Л. и др.Симбионты как основные модуляторы здоровья насекомых: молочнокислые бактерии и медоносные пчелы. PLoS ONE. 2012; 7: e33188. pmid: 22427985
  47. 47. Аль-Вайли Н., Салом К., Аль-Гамди А., Ансари М.Дж. Антибиотики, пестициды и микробные загрязнители меда: опасность для здоровья человека. Мировой научный журнал. 2012; 2012: 9. pmid: 23097637
  48. 48. Динков Д., Канелов И., Желязкова И. Стойкость тетрациклина и окситетрациклина в пчелином меде после неправильного применения на пчелиных семьях.Болгарский журнал ветеринарной медицины. 2005. 8: 205–209.
  49. 49. Комитет по статусу опылителей в Северной Америке, Национальный исследовательский совет. Состояние опылителей в Северной Америке. Вашингтон, округ Колумбия: Национальная академия прессы; 2007. https://www.nap.edu/read/11761/chapter/1.
  50. 50. Эванс Дж. Д., Чен Ю. П., Приско Дж., Петтис Дж. Чашки для пчел: одноразовые клетки для экспериментов с медоносными пчелами. J Apicul Res. 2009. 48: 300–302.
  51. 51. Капорасо Дж. Г., Лаубер С. Л., Уолтерс В. А., Берг-Лайонс Д., Хантли Дж., Фирер Н. и др.Сверхвысокопроизводительный анализ микробного сообщества на платформах Illumina HiSeq и MiSeq. ISME J. 2012; 6: 1621–1624. pmid: 22402401
  52. 52. Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, Bittinger K, Bushman FD, Costello EK, et al. QIIME позволяет анализировать данные секвенирования сообщества с высокой пропускной способностью. Нат методы. 2010. 7: 335–336. pmid: 20383131
  53. 53. Pruesse E, Quast C, Knittel K, Fuchs BM, Ludwig W, Peplies J, et al. SILVA: всеобъемлющий онлайн-ресурс для проверенных и согласованных данных о последовательностях рибосомных РНК, совместимых с ARB.Nucleic Acids Res. 2007. 35: 7188–7196. pmid: 17947321
  54. 54. Вилгалис Р., Хестер М. Быстрая генетическая идентификация и картирование ферментативно амплифицированной рибосомальной ДНК нескольких видов Cryptococcus . J Bacteriol. 1990; 172: 4238–4246. pmid: 2376561
  55. 55. Гардес М, Брунс ТД. Праймеры ITS с повышенной специфичностью для базидиомицетов — применение для идентификации микоризы и ржавчины. Mol Ecol. 1993; 2: 113–118. pmid: 8180733
  56. 56.Alm EW, Oerther DB, Larsen N, Stahl DA, Raskin L. База данных олигонуклеотидных зондов. Appl Environ Microbiol. 1996; 62: 3557–3559. pmid: 8837410
  57. 57. Сток I, Бурак С., Шервуд К.Дж., Грюгер Т., Видеманн Б. Естественная антимикробная чувствительность штаммов «необычных» видов Serratia: S . фикария , S . Фонтикола , S . odorifera , S . plymuthica и S . rubidaea . J Antimicrob Chemother. 2003; 51: 865–885 pmid: 12654765

Интенсивность инфекции Nosema ceranae связана со специфическими кишечными бактериями медоносных пчел и слабо связана со структурой кишечного микробиома.

  • 1.

    Морс Р. А. и Кальдероне Н. В. Ценность медоносных пчел как опылителей сельскохозяйственных культур в США в 2000 г. Bee Cult. 128 , 1–15 (2000).

    Google ученый

  • 2.

    Уинфри, Р., Гросс, Б. Дж. И Кремен, К. Оценка услуг опыления для сельского хозяйства. Ecol. Эконом. 71 , 80–88 (2011).

    Артикул Google ученый

  • 3.

    Кляйн, А.-М. и др. . Значение опылителей в изменении ландшафтов мировых культур. Proc. Рой. Soc. B 274 , 303–313 (2007).

    Артикул Google ученый

  • 4.

    Лоузи, Дж. Э. и Воган, М. Экономическая ценность экологических услуг, предоставляемых насекомыми. BioScience 56 , 311–323 (2006).

    Артикул Google ученый

  • 5.

    Ли К. В. и др. . Национальное исследование ежегодных потерь колоний пчел, выращиваемых в США, в 2013–2014 гг. Apidologie 46 , 292–305 (2015).

    Артикул Google ученый

  • 6.

    Макменамин, А. Дж. И Генерш, Е. Потери колоний медоносных пчел и связанные с ними вирусы. Curr. Opin. Insect Sci. 8 , 121–129 (2015).

    Артикул Google ученый

  • 7.

    Гоулсон, Д., Николлс, Э., Ботиас, К. и Ротери, Э. Л. Пчелиный упадок снижается из-за комбинированного стресса от паразитов, пестицидов и отсутствия цветов. Наука 347 , 1255957–1255957 (2015).

    Артикул Google ученый

  • 8.

    Пакстон, Р. Дж., Клее, Дж., Корпела, С. и Фрис, I. Nosema ceranae инфицировал Apis mellifera в Европе по крайней мере с 1998 г. и может быть более вирулентным, чем Nosema apis . Apidologie 38 , 558–565 (2007).

    Артикул Google ученый

  • 9.

    Chaimanee, V. et al. . Восприимчивость четырех разных видов медоносных пчел к Nosema ceranae . Вет. Паразит. 193 , 260–265 (2012).

    Артикул Google ученый

  • 10.

    Fries, I. Nosema ceranae у европейских медоносных пчел ( Apis mellifera ). J. Invert. Дорожка. 103 (Приложение 1), S73–9 (2010).

    Артикул Google ученый

  • 11.

    Aufauvre, J. et al. . Взаимодействие паразитов и инсектицидов: тематическое исследование Nosema ceranae и синергия фипронила на медоносных пчелах. Sci. Отчет 2 , 1–7 (2012).

    Артикул Google ученый

  • 12.

    Петтис, Дж. С., Ван Энгельсдорп, Д., Джонсон, Дж. И Дивели, Г. Воздействие пестицидов на медоносных пчел приводит к повышению уровня кишечного патогена. Нозема. Naturwiss. 99 , 153–158 (2012).

    ADS CAS Статья Google ученый

  • 13.

    Хигес, М., Меана, А., Бартоломе, К., Ботиас, К. и Мартин-Эрнандес, Р. Nosema ceranae (Microsporidia), вызывающий споры возбудитель медоносных пчел 21 века. Environ. Микро. Отчет 5 , 17–29 (2013).

    Артикул Google ученый

  • 14.

    Kralj, J. & Fuchs, S. Nosema sp. влияет на летное поведение инфицированных пчел ( Apis mellifera )-собирателей. Apidologie 41 , 21–28 (2009).

    Артикул Google ученый

  • 15.

    Мартин-Эрнандес, Р. и др. . Сравнение энергетического стресса, связанного с экспериментальной инфекцией Nosema ceranae и Nosema apis медоносных пчел ( Apis mellifera ). Паразит. Res. 109 , 605–612 (2011).

    Артикул Google ученый

  • 16.

    Хуанг, В.-F. И Солтер Л.Ф. Сравнительное развитие и тканевой тропизм Nosema apis и Nosema ceranae . J. Invert. Дорожка. 113 , 35–41 (2013).

    Артикул Google ученый

  • 17.

    Chaimanee, V., Chantawannakul, P., Chen, Y. P., Evans, J. D. & Pettis, J. S. Дифференциальная экспрессия иммунных генов взрослой медоносной пчелы ( Apis mellifera ) после инокулирования Nosema ceranae . J. Ins. Phys. 58 , 1090–1095 (2012).

    CAS Статья Google ученый

  • 18.

    Форсгрен, Э. и Фрис, И. Сравнительная вирулентность Nosema ceranae и Nosema apis у отдельных европейских медоносных пчел. Вет. Паразит. 170 , 212–217 (2010).

    Артикул Google ученый

  • 19.

    Мартин-Эрнандес, Р. и др. .Nosema ceranae в Apis mellifera : через 12 лет после обнаружения. Environ. Микро. 20 , 1302–1329 (2018).

    Артикул Google ученый

  • 20.

    Вилла, Дж. Д., Буржуа, А. Л. и Данка, Р. Г. Отрицательные доказательства влияния генетического происхождения пчел на Nosema ceranae , положительные доказательства воздействия Nosema ceranae на пчел. Apidologie 44 , 511–518 (2013).

    Артикул Google ученый

  • 21.

    Jara, L. и др. . Связь эволюционного происхождения с преобладанием паразитов и патогенов у иберийской медоносной пчелы. J. Invert. Дорожка. 110 , 8–13 (2012).

    Артикул Google ученый

  • 22.

    Энгель П., Мартинсон В. Г. и Моран Н. А. Функциональное разнообразие микробиоты простого кишечника медоносной пчелы. PNAS 109 , 11002–11007 (2012).

    ADS CAS Статья Google ученый

  • 23.

    Чжэн, Х., Пауэлл, Дж. Э., Стил, М. И., Дитрих, К. и Моран, Н. А. Микробиота кишечника медоносной пчелы способствует увеличению веса хозяина за счет метаболизма бактерий и гормональной передачи сигналов. PNAS 114 , 4775–4780 (2017).

    CAS Статья Google ученый

  • 24.

    Чжэн, Х. и др. . Метаболизм токсичных сахаров штаммами симбионта пчелиного кишечника Gilliamella apicola . mBio 7 , 661–9 (2016).

    Артикул Google ученый

  • 25.

    Энгель, П. и др. . Микробиом пчелы: влияние на здоровье пчел и модель эволюции и экологии взаимодействия хозяина и микроба. mBio 7 , e02164–15–9 (2016).

  • 26.

    Мартинсон, В. Г., Мой, Дж. И Моран, Н. А. Создание характерных кишечных бактерий во время развития пчеловодства. Заявл. Environ. Микро. 78 , 2830–2840 (2012).

    CAS Статья Google ученый

  • 27.

    Квонг, В. К., Манленидо, А. Л. и Моран, Н. А. Стимуляция иммунной системы естественной кишечной микробиотой медоносных пчел. Королевское общество, открытая наука 4 , 170003–9 (2017).

    Артикул Google ученый

  • 28.

    Пикард, Дж. М., Зенг, М. Ю., Карузо, Р. и Нуньес, Г. Микробиота кишечника: роль в колонизации патогенов, иммунных ответах и ​​воспалительных заболеваниях. Immuno. Ред. 279 , 70–89 (2017).

    CAS Статья Google ученый

  • 29.

    Хиллман, К. и Гудрич-Блер, Х. Ты мой симбионт? Микробные полиморфные токсины и противомикробные соединения как достоверные сигналы полезных симбиотических защитных свойств. Curr. Opin. Microbiol. 31 , 184–190 (2016).

    CAS Статья Google ученый

  • 30.

    Мюллер, У. Г. и Сакс, Дж. Л. Разработка микробиомов для улучшения здоровья растений и животных. Trends Microbiol. 23 , 606–617 (2015).

    CAS Статья Google ученый

  • 31.

    Corby-Harris, V. и др. . Parasaccharibacter apium , gen. nov., sp. nov., улучшает устойчивость медоносных пчел (Hymenoptera: Apidae) к Nosema . Экотокс . 1–7, 10.1093 / jee / tow012 (2016).

  • 32.

    Baffoni, L. et al. . Влияние пищевых добавок штаммов Bifidobacterium и Lactobacillus на Apis mellifera L. против Nosema ceranae . Бенеф. Микробы 7 , 1–8 (2015).

    Google ученый

  • 33.

    Ли, Дж. Х. и др. . Новые данные, показывающие, что уничтожение кишечных бактерий с помощью лечения антибиотиками может повысить уязвимость медоносных пчел к инфекции Nosema . PLOS ONE 12 , e0187505 (2017).

    Артикул Google ученый

  • 34.

    Hubert, J. et al. . Изменения в бактериоме медоносных пчел связаны с паразитом Varroa destructor и возбудителями Nosema и Lotmaria passim . Экология микробов 73 , 1–14 (2016).

    Google ученый

  • 35.

    Буржуа, А. Л., Биман, Л. Д., Холлоуэй, Б. и Риндерер, Т. Е. Внешнее и внутреннее обнаружение Nosema ceranae на медоносных пчелах с использованием ПЦР в реальном времени. J. Invert. Дорожка. 109 , 1–3 (2012).

    Артикул Google ученый

  • 36.

    Fries, I. и др. . Стандартные методы исследования ноземы. J. Apic. Res. 52 , 1-28 (2015).

    ADS Статья Google ученый

  • 37.

    Баер Б. и Шмид-Хемпель П. Экспериментальные вариации полиандрии влияют на паразитарные нагрузки и приспособленность шмелей. Nature 397 , 151–154 (1999).

    ADS CAS Статья Google ученый

  • 38.

    Моран, Н. А., Хансен, А. К., Пауэлл, Дж. Э. и Сабри, З. Л. Отличительная кишечная микробиота медоносных пчел, оцененная с помощью глубокого отбора проб у отдельных рабочих пчел. PLOS ONE 7 , e36393–10 (2012).

    ADS CAS Статья Google ученый

  • 39.

    Андерсон К. Э. и Ричильяно В. А. Дисбактериоз кишечника медоносных пчел: новый контекст экологии болезней. Curr. Opin. Insect Sci. 22 , 125–132 (2017).

    Артикул Google ученый

  • 40.

    Maes, PW, Rodrigues, AP, Oliver, P., Mott, BM & Anderson, KE Бактериальный дисбактериоз кишечника, связанный с диетой, коррелирует с нарушением развития, повышенной смертностью и Nosema у медоносных пчел ( Apis mellifera). Мол . Экол . 1–31, https://doi.org/10.1111/mec.13862 (2016).

  • 41.

    Webster, T. C., Pomper, K.У., Хант, Г., Такер, Э. М. и Джонс, С. С. Инфекция Nosema apis у рабочих и маток Apis mellifera . Apidologie 35 , 49–54 (2004).

    Артикул Google ученый

  • 42.

    Буржуа А. Л., Риндерер Т. Э., Биман Л. Д. и Данка Р. Г. Генетическое обнаружение и количественная оценка Nosema apis и N . ceranae у медоносной пчелы. Дж.Инвертировать. Дорожка. 103 , 53–58 (2010).

    CAS Статья Google ученый

  • 43.

    Ricigliano, V.A. et al. . Медоносные пчелы, перезимовавшие в южном климате: продольные эффекты питания и возраста матки на молекулярную физиологию и продуктивность на уровне колонии. Sci . Репу . 1–11, https://doi.org/10.1038/s41598-018-28732-z (2018).

  • 44.

    Энгель, П. и др. .Стандартные методы исследования кишечных симбионтов Apis mellifera . J. Apic. Res. 52 , 1–24 (2015).

    Артикул Google ученый

  • 45.

    Hanshew, A. S., Mason, C. J., Raffa, K. F. & Currie, C. R. Минимизация загрязнения хлоропластами при пиросеквенировании гена 16S рРНК бактериальных сообществ насекомых-травоядных. Журнал микробиологических методов 95 , 149–155 (2013).

    CAS Статья Google ученый

  • 46.

    Kembel, S. W. et al. . Взаимосвязь между филлосферными бактериальными сообществами и функциональными особенностями растений в неотропическом лесу. PNAS 111 , 13715–13720 (2014).

    ADS CAS Статья Google ученый

  • 47.

    МакФредерик, К. С. и Рехан, С. М. Характеристика пыльцы и состава бактериального сообщества в условиях расплода небольшой пчелы-плотника. Мол. Ecol. 25 , 2302–2311 (2016).

    CAS Статья Google ученый

  • 48.

    R Основная группа. R: Язык и среда для статистических вычислений. R Фонд статистических вычислений (2018).

  • 49.

    Caporaso, J. G. et al. . QIIME позволяет анализировать данные секвенирования сообщества с высокой пропускной способностью. Nat. Методы 7 , 335–336 (2010).

    CAS Статья Google ученый

  • 50.

    Оксанен, Дж. и др. . Веган: экологический пакет для сообщества. Пакет R версии 2.4-3. Версия пакета R 2 , 4–3 (2017).

    Google ученый

  • 51.

    Каллахан Б. Дж. и др. . DADA2: вывод образца с высоким разрешением из данных ампликона Illumina. Nat. Методы 13 , 581–583 (2016).

    CAS Статья Google ученый

  • 52.

    Quast, C. и др. . Проект базы данных генов рибосомной РНК SILVA: улучшенная обработка данных и веб-инструменты. Исследование нуклеиновых кислот 41 , D590 – D596 (2012).

    Артикул Google ученый

  • 53.

    Бокулич Н.А. и др. . Оптимизация таксономической классификации последовательностей ампликонов маркерных генов с помощью подключаемого модуля q2-feature-classifier QIIME 2.1–17, https://doi.org/10.1186/s40168-018-0470-z, (2018).

  • 54.

    Катох, К., Мисава, К., Кума, К.-И. И Мията, Т. MAFFT: новый метод быстрого множественного выравнивания последовательностей, основанный на быстром преобразовании Фурье. Nucleic Acids Research 30 , 3059–3066 (2002).

    CAS Статья Google ученый

  • 55.

    Прайс, М. Н., Дехал, П. С. и Аркин, А. П. FastTree 2 — деревья приблизительно максимального правдоподобия для больших выравниваний.

  • Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *